КНОРРЕ_3227

вавших избытков существенно удорожает синтез. Это не играет большой ро­ ли, когда нужно получить за короткое время небольшие (микрограммовые) количества разнообразных олигонуклеотидов. Однако если речь идет о полу­ чении продукта в значительных количествах для дальнейших исследований, возрастание избытка синтона на каждой стадии делает синтез малоэкономич­ ным. Поэтому проблема получения путем автоматического синтеза препара­ тивных количеств продукта требует улучшения стадии конденсации, и в этом направлении еще предстоит серьезная работа.

5.4.2. Олигонуклеотидные микрочипы

В последние годы стали все чаще возникать задачи, требующие одновре­ менного синтеза очень большого числа различных иммобилизованных на подложке олигонуклеотидов. Это находит особенно широкое применение для создания так называемых микрочипов, которые требуются для проведения гибридизационного анализа с участием одновременно большого числа участ­ вующих в гибридизации олигонуклеотидов. Первоначально подход разраба­ тывался для создания нового метода секвенирования нуклеиновых кислот. На подложку можно нанести в виде отдельных пятен, например, 4096 (84) окта­ нуклеотидов, представляющих собой все мыслимые последовательности из восьми нуклеотидов. Каждая последовательность занимает определенное ме­ сто на подложке (микрочипе). Поэтому по положению сигнала, полученного от какой-либо точки на микрочипе, однозначно определяется, с каким олиго­ нуклеотидом связано наличие этого сигнала. Например, гибридизация нахо­ дящихся на чипе олигонуклеотидов с фрагментом ДНК, несущим флуорес­ центную метку, позволяет по положению флуоресцирующих пятен опреде­ лить, с какими октануклеотидами гибридизуется фрагмент и, следовательно, какие нуклеотидные последовательности присутствуют в этом фрагменте. По этим данным можно, как правило, установить полную последовательность нуклеотидов в этом фрагменте. Такой подход оказался весьма эффективным для выявления наличия мутаций в исследуемом образце, например, вирусной нуклеиновой кислоты, причем, естественно, он годится и для исследования вирусных РНК.

Подход, основанный на синтезе большого набора однотипных соедине­ ний, сканирование этого набора и выявление тех, которые несут интересую­ щее исследователя свойство (в рассмотренном случае - способность гибридизоваться с исследуемой нуклеиновой кислотой), относят к основной задаче

комбинаторной химии.

Естественно, что создать такие чипы можно, проведя химический синтез всех необходимых для анализа олигонуклеотидов и затем нанося их с помо­ щью специального механического устройства на подложку с целью иммоби­ лизации. Однако более перспективной представляется возможность осущест­ вить одновременный синтез всего набора олигонуклеотидов непосредственно

§ 5.5. Полимеразная цепная реакция

Возможность практически неограниченного размножения дуплексов, описанная в § 1.3, лежит в основе нашедшего широчайшее применение в практике процесса, получившего название полимеразная цепная реакция (ПЦР), или амплификация. Существует несколько различных вариантов ис­ пользования ПЦР, но для того, чтобы понять принцип процесса, в качестве примера можно ограничиться описанием процесса получения большого чис­ ла копий некоторого двунитевого фрагмента ДНК. При этом предполагается, что нуклеотидная последовательность фрагмента известна. Схема процесса представлена на рис. 45.

На стадии (аО исходная двунитевая ДНК 1 частично или полностью дена­ турируется, чтобы подлежащие амплификации участки превратились в однонитевые и могли образовывать комплексы с соответствующими праймерами. Это достигается нагреванием образца до температуры, существенно превы­ шающей температуру плавления дуплекса (см. § 5.1). Если нуклеотидные по­ следовательности достаточно протяженных участков 3’-концов амплифицируемых фрагментов известны, тогда праймеры получают синтетически. При быстром охлаждении и достаточном избытке праймеров разделенные участ­ ки на стадии (б|) образуют комплексы (Г ) и (1” ) с праймерами, и в присут­ ствии ДНК-полимеразы и четырех dNTP на стадии (вО происходит синтез цепи (2’ и 2 ”), комплементарной амплифицируемому фрагменту и фланки­ рующей его 5’-конец полинуклеотидной цепи. Совокупность стадий (а), (б) и (в) обычно квалифицируется как цикл амплификации. Дальнейшая процедура состоит в последовательном чередовании аналогичных циклов - нагревания для денатурации дуплексов, охлаждения для комплексообразования с прай­ мерами и репликации с помощью ДНК-полимеразы.

ПЦР проводится без каких-либо промежуточных разделений смеси, и ис­ ходная ДНК присутствует на всех последующих стадиях амплификации, но по мере умножения количества полинуклеотидного материала ее доля про­ грессивно уменьшается и становится исчезающе малой. В каждом после­ дующем цикле амплификации на ней, как на матрице, производятся новые полинуклеотиды 2’ и 2”, причем их содержание возрастает линейно. В то же время они ведут себя как матрицы, на них образуются полинуклеотиды 3’ иЗ” , полностью воспроизводящие обе нити амлифицируемого фрагмента, но, в отличие от 2’ и 2” , не содержащие каких-либо дополнительных цепей. Эти полинуклеотиды в последующих циклах служат матрицами для самовоспроизводства, т. е. в каждом последующем цикле их количество удваивается и, следовательно, растет экспоненциально. Так, повторение процесса п раз теоретически приводит к увеличению числа дуплексов в 2П'2 раза, например, за 20 циклов амплификации число дуплексов может увеличиться более чем

в 105раз. Поэтому в конце амплификации доля полинуклеотидов 2’ и 2” ни­ чтожна.

Чтобы избежать повторного добавления фермента при повторении стадий амплификации, используют ферменты из термофильных организмов, кото­ рые сохраняют свою активность при повышении температуры на стадии плавления дуплекса. Чаще всего используют фермент из бактерий thermus aquaticus (Гад-полимераза).

Определить полученное количество амплифицированных дуплексов, т. е. эффективность амплификации, можно, проанализировав полученный про­ дукт путем электрофореза конечной реакционной смеси.

Практически при проведении ПЦР результат амплификации может не достигать приведенного выше масштаба (неполная денатурация на стадии плавления, неполное образование дуплексов с праймерами, инактивация фермента). Поэтому развито несколько методов количественного наблюде­ ния за ходом процесса (ПЦР в реальном времени). Все они основаны на ис­ пользовании регистрации флуоресценции по ходу процесса. Одним из подхо­ дов является определение в процессе ПЦР количества дуплексов, которое можно регистрировать с помощью специальных красителей, обладающих флуоресценцией, резко возрастающей при интеркаляции в полинуклеотидную двойную спираль. К числу таких интеркаляторов относится, в частности, широко используемый в практике ПЦР краситель SYBR green I (Xmax возбуж­ дения 498 нм, Хщах испускания 522 нм).

Амплификация может быть использована и для получения некоторых производных олигонуклеотидов и фрагментов ДНК. Можно в качестве прай­ меров использовать олигонуклеотиды, имеющие на 5’-конце группу, которую желательно ввести в продукт амплификации, например, биотин. Последний, в силу своего исключительно высокого сродства к белкам авидину и стрептавидину, позволяет избирательно сорбировать продукты амплификации на соответствующем иммобилизованном белке. Кроме того, при репликации можно вводить некоторые производные dNTP, у которых к гетероциклу при­ соединена какая-либо группа, например, фотореакционноспособная, если она не препятствует участию такого производного dNTP в реакции элонгации.

Полимеразная цепная реакция нашла многочисленные практические при­ менения в тех случаях, когда в распоряжении исследователя имеется недос­ таточное количество биологического материала. В первую очередь с этой проблемой сталкиваются при пренатальной диагностике, позволяющей вы­ явить нежелательные генетические отклонения на ранних стадиях развития плода. С необходимостью увеличить количество генетического материала приходится иметь дело при изучении генетического материала ископаемых биологических объектов. С этой же проблемой сталкиваются в судебной практике для установления личности преступника по оставленным им следам и для установления отцовства. В силу большой практической значимости ПЦР и необходимости проводить многократно повторяющиеся операции в настоящее время выпускаются специальные приборы - амплификаторы.

§ 5.6. Соединение олигонуклеотидов, расположенных стык в стык на комплементарной матрице

Длина природных генов слишком велика, чтобы можно было осущест­ вить их синтез в виде одного, пусть и многостадийного, процесса. Это было тем более немыслимо в период синтеза первого гена. Поэтому Корана пред­ ложил синтезировать сравнительно короткие олигонуклеотиды, способные организовать дуплексную структуру с разрывами, которые можно соединить между собой подобно тому, как это делается в природе при репликации ДНК с воссоединением фрагментов Оказаки (см. § 1.3). Суть этого процесса со­ стоит в соединении олигонуклеотидов на комплементарной матрице. На рис. 46 представлена схема процесса на примере сборки такой структуры из пяти олигонуклеотидов.

Для соединения олигонуклеотидов I и II используется вспомогательный олигонуклеотид III, 5’-конец которого комплементарен 5’-концу олигонукле­ отида I, а З’-конец - З’-концу олигонуклеотида II. В присутствии ДНК-лигазы и донора фосфата (АТР или NAD+) происходят последовательно перенос фосфата от донора к 5’-концевому фосфату олигонуклеотида I и образование межнуклеотидной связи между концами соединяемых олигонуклеотидов с отщеплением ортофосфата. При этом на обоих концах дуплекса, образо­ ванного соединенным олигонуклеотидом I-II и олигонуклеотидом III, обра­ зуются выступающие однонитевые концы, которые могут быть использованы для присоединения аналогичным образом двух олигонуклеотидов IV и V. Если при этом образуются новые выступающие однонитевые концы, то про­ цедура может быть продолжена. Соединение двух олигонуклеотидов, ориен­ тированных относительно друг друга за счет их взаимодействия со вспомогатель­ ной комплементарной нуклеиновой кислотой, принято называтьлигированием.

При синтезе гена, предназначенного для встраивания в какую-либо несу­ щую конструкцию (геном или плазмиду), на его концах оставляют выступаю-

Рис. 46. Схема ступенчатой сборки фрагмента двуспиральной ДНК из олигодезоксирибонуклеотидов I, И, III, IV, V путем ферментативного соединения 5’- концевого фосфата одного и 3’-концевой ОН-группы другого олигонуклеотида, соб­ ранных стык в стык на комплементарной матрице. Обозначения те же, что на рис. 45

щие концы, комплементарные однонитевым концам, образовавшимся при разрезании несущей конструкции какой-либо рестриктазой. Затем при обра­ ботке раствора, содержащего синтезированный ген и разрезанную несущую конструкцию, ДНК-лигазой и донором фосфата образуется нужная структура. Схема встраивания гена в плазмиду путем лигирования приведена на рис. 47.

Использование схемы ступенчатой сборки полинуклеотидов открыло путь к синтезу длинных полинуклеотидных цепей из химически синтезиро­ ванных олигонуклеотидов. В ее классическом виде она содержит как хими­ ческую, так и ферментативную стадию, и эта стратегия известна как химико­ ферментативный синтез. Наряду с этим в Московском государственном уни­ верситете 3. А. Шабаровой был предложен и разработан чисто химический метод, основанный на химическом соединении олигонуклеотидных фрагмен­ тов в дуплексах, т. е. на химическом лигировании. Удобным реагентом для этой цели оказался бромциан, с помощью которого химическое лигирование протекает за минуты. Важной особенностью этого подхода является возмож­ ность получать дуплексы, а тем самым и олигонуклеотиды, содержащие не­ природные типы связей, и нуклеотиды, содержащие вместо рибозы другие углеводы. Например, при лигировании двух олигонуклеотидов, один из кото-

118 Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот

\

-рСрТ pGpCpApG - -GpApCpGpTрСр -

t

© j

Рис. 47. Схема встраивания синтезированного гена в плазмиду: 1 - расщепление плазмиды по сайту узнавания; 2 - добавление к разрезанной плазмиде встраиваемого гена с липкими концами; 3 - сшивание конструкции с помощью ДНК-лигазы

рых на стыкующемся конце имеет 3’-, а другой - 5’-фосфат, получается оли­ гонуклеотид, в котором два остатка нуклеозида связаны пирофосфатной группой.

Сближение двух способных реагировать между собой групп, связанных с олигонуклеотидами, с помощью вспомогательной комплементарной нук­ леиновой кислоты (матрицы) моделирует один из основных факторов, дейст­ вующих при ферментативном катализе. Однако такой процесс не является каталитическим, поскольку речь идет об одноактном процессе. В то же время такое сближение и, таким образом, кардинальное ускорение реакции могут быть осуществлены не только для соединения фосфата с ОН-группой или двух фосфатов, но и для других многочисленных, способных взаимодействовать групп.

§ 5.7. Производные и аналоги олигонуклеотидов

Производные и аналоги олигонуклеотидов примененяются как в самой биоорганической химии, так и в ее многочисленных приложениях. Это обу­ словлено в первую очередь двумя важными свойствами олигонуклеотидов: их способностью к специфичным взаимодействиям с комплементарными по­ следовательностями в составе нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов и способностью олигонуклеотидов с некоторыми уникальными последователь­ ностями специфично взаимодействовать с определенными ферментами, имеющими активные центры, которые узнают такие последовательности.

В § 5.5 уже было описано применение олигонуклеотидов для создания микрочипов для выявления мутаций. Связывание олигонуклеотидов с функ­ ционально значимыми фрагментами однонитевых ДНК и мРНК существенно влияет на экспрессию этих нуклеиновых кислот и рассматривается как пер­ спективный подход к значительному ослаблению или полному подавлению такой экспрессии. Указанный подход, получивший название антисмыслового, детально рассматривается в § 12.3.

Производные олигонуклеотидов создаются для придания им некоторых новых свойств. Для детекции флуоресцентными методами широко использу­ ется присоединение к олигонуклеотидам соответствующих красителей; для придания им гидрофобности с целью облегчить их прохождение через био­ логические мембраны их связывают с объемными неполярными радикалами. Несвойственную реакционную способность можно обеспечить путем при­ соединения к ним соответствующих химически активных групп. Для прида­ ния им специфической сорбируемости на твердых носителях к ним присое­ диняют специальные радикалы, например, биотин для сорбции на носителях, содержащих стрептавидин.

Практически все задачи, связанные с применением производных олиго­ нуклеотидов, предполагают использование их способности к высокоспеци­ фичным взаимодействиям. Поэтому получение производных не должно со­ провождаться нарушениями тех элементов структуры, которые обеспечивают такие взаимодействия. В случае, когда предполагается использовать способ­ ность олигонуклеотидов к образованию дуплексных структур, в производных должны сохраняться стороны гетероциклов, обеспечивающие специфичные взаимодействия. Однако можно использовать противоположные стороны. У пиримидиновых гетероциклов таковыми являются атомы С5 и С6, у пури­ нов - имидазольная часть пуриновых циклов. У последних, в частности, можно заменить атом N7 на атом С. Атом С8 можно использовать для при­ соединения не слишком объемистых остатков, поскольку нужно избегать пе­ рехода модифицированного пурина из анти- в син-конформацию, так как