КНОРРЕ_3227

ной узкой области (изоэлектрическая фокусировка). Кроме того, при данном значении pH, как правило, существенно снижается растворимость белка, по­ скольку исчезает ионная атмосфера вокруг его молекул, предотвращающая их слипание.

6.1.4. Спектральные свойства аминокислот и белков

В близком ультрафиолетовом диапазоне длин волн характерное для амино- или карбоксильных групп поглощение света отсутствует. В этой области УФ-поглощение наблюдается только у аминокислот, имеющих ароматиче­ ские циклы: фенилаланина, тирозина и триптофана. В табл. 11 приведены длины волн в максимуме поглощения и молярные коэффициенты экстинкции при этих длинах волн. При наличии таких аминокислот в составе белков по­ следние тоже поглощают УФ-излучение в этой же области спектра. Из-за влияния окружающих групп как положение максимума поглощения, так и его интенсивность несколько отличаются от таковых для свободных аминокис­ лот, но эти отличия невелики. Пептидная связь поглощает в области 190-230 нм безотносительно к природе образующих ее аминокислотных остатков.

Важной спектральной характеристикой является способность остатков триптофана к флуоресценции. Свободный триптофан имеет максимум возбу­ ждения (exitation) при = 295 нм, а максимум испускания (emission) при Хеш= 353 нм с квантовым выходом 0,14. Спектральные характеристики флуо­ ресценции остатков триптофана в составе белков чувствительны к их окру­ жению, и измерение флуоресценции белков дает представление об их про­ странственной структуре. Благодаря высокой чувствительности измерение флуоресценции позволяет регистрировать ее за очень малые промежутки времени и наблюдать за изменением конформации в миллисекундном диапа­ зоне. Довольно интенсивной флуоресценцией обладает тирозин (^ х = 275 нм,

Хет= 304 нм).

§6.2. Основные функции белков

6.2.1.Белки как катализаторы (ферменты)

Среди важнейших функций белков в первую очередь следует сказать об их участии в катализе многочисленных химических превращений, происхо­ дящих в живых организмах. Практически ни одно химическое превращение, свойственное живым организмам, при биологически значимых температурах и условиях среды не происходит без помощи соответствующего биологиче­ ского катализатора - фермента (энзима). За редкими исключениями (рибозимы, ДНКзимы, см. § 16.5) ферменты являются либо белками, либо их ком­ плексами или конъюгатами с дополнительными кофакторами - ионами ме­ таллов или специальными органическими молекулами. Ковалентно связан­

ные с полипептидным остовом кофакторы называют простетическими груп­ пами. Если в отсутствие кофактора белок каталитической активностью не обладает, то белковую часть фермента называют апоферментом. Последний организует работу кофакторов, располагая их таким образом, чтобы наиболее активно реализовался их каталитический потенциал. Вещества, подвергаю­ щиеся превращению - субстраты, узнаются ферментом и образуют ком­ плекс, в котором они правильно ориентированы относительно групп белка, участвующих в каталитическом акте, и кофактора. Скорости реакций, катали­ зируемых ферментами, обычно во много раз превосходят скорости аналогич­ ных реакций, катализируемых обычными неорганическими и органическими катализаторами. Например, одна молекула фермента каталазы катализирует разложение за секунду 50 тыс. молекул пероксида водорода. Эту же реакцию можно катализировать ионами железа. В результате, чтобы достичь такой же скорости, какая обеспечивается молекулой каталазы, необходимо участие столько количества катализатора, сколько содержит две тонны железа.

Если реакция проходит между двумя субстратами, то белок способствует их сближению на своей поверхности. В большом числе случаев ферменты дополнительно взаимодействуют с молекулами веществ, которые, индуцируя направленный конформационный переход, либо подавляют каталитическую активность (ингибиторы), либо стимулируют ее (активаторы).

6.2.2. Регуляторные функции белков. Основные регуляторные системы животных

Огромное число белков участвует в регуляции биохимических процессов. Регуляция необходима уже для достаточно просто устроенных одноклеточ­ ных организмов, таких как бактерии. В качестве примера можно привести белки-репрессоры, которые по мере необходимости включают или выключа­ ют ферментативные процессы в клетке. Например, для большого числа кле­ ток источником углерода для осуществления синтезов разнообразных соеди­ нений и производства энергии являются глюкоза и некоторые димерные са­ хара, такие как сахароза, состоящая из остатков глюкозы и фруктозы, или мальтоза, построенная из двух остатков глюкозы. Однако в питательной сре­ де в некоторых случаях может оказаться молочный сахар - лактоза, молекула которой состоит из одной молекулы глюкозы и одной молекулы ее изомера - галактозы. Лактоза, попавшая в бактериальную клетку, подвергается под действием фермента fi-галактозидазы расщеплению на глюкозу и галактозу, которая используется далее для тех же целей, что и глюкоза. Однако произ­ водство этого фермента не имеет смысла, если в среде лактоза отсутствует. Поэтому в норме такое производство подавлено с помощью специального белка - лактозного репрессора (lac-penpeccop'). Когда в системе появляется лактоза, она образует комплекс с репрессором, и происходит направленный конформационный переход, выключающий функционирование репрессора.

132 Глава 6. Белки. Основные принципы строения и функции

Однако в неизмеримо большей степени регуляция характерна для много­ клеточных организмов. В процессе эволюции у высших эукариот сформиро­ вались две основные системы регуляции - нервная и эндокринная.

Роль эндокринной системы состоит в наработке специальных химических веществ, называемых гормонами, которые играют роль сигналов, посылае­ мых в определенных физиологических состояниях организма к соответст­ вующим органам-мишеням. Первичная реакция мишени на присутствие гормо­ на состоит во взаимодействии его со специальным белком - рецептором гормо­ на. Гормонам посвящена глава 17.

Второй регуляторной системой является нервная система. Она присуща всем достаточно высокоразвитым животным, в том числе и человеку.

Функционирование нервной системы заключается в проведении электри­ ческих сигналов в виде нервных импульсов от головного и спинного мозга по специальным конструкциям - нейронам (нервным клеткам). У позвоночных нервные клетки имеют множество отростков - дендритов, которые сконцен­ трированы в мозге и соединены практически со всеми частями организма. Самые длинные отростки - аксоны - имеют особое строение, позволяющее передавать по ним сигналы. Аксоны могут достигать нескольких метров в длину и способны передавать электрический сигнал со скоростью несколь­ ких метров в секунду. Возникновение и передача электрического сигнала обеспечивается действием специального фермента - Ыа+,К+-зависимой АТФазы. Фермент функционирует в составе клеточной мембраны и обеспе­ чивает создание и сохранение в течение некоторого времени разности потен­ циалов между окружающей средой и внутренним содержимым клетки. Этот вопрос будет рассмотрен в главе 15, посвященной структуре и функциям биологических мембран.

В сочетании с органами чувств нервная система получает разнообразную информацию от окружающей среды, превращает ее в сигналы, которые пере­ даются исполнительным органам или хранятся в коре головного мозга для дальнейшего применения по мере необходимости. Детальное описание нерв­ ной системы является задачей физиологии, и в данном параграфе представ­ лены лишь наиболее существенные сведения о событиях, обеспечивающих функционирование этой системы.

Нейроны способны генерировать электрические импульсы и передавать информацию на нервные, мышечные и секреторные, т. е. возбудимые клетки. Эта передача происходит в специализированных структурных окончаниях, называемых синапсами, образованными соответствующими окончаниями взаимодействующих клеток.

Синапс представляет собой сложную структуру и состоит из пресинаптической части (окончание аксона, передающего сигнал), синаптической щели и постсинаптической части (структуры воспринимающей клетки). Сигнал нервного импульса приводит к секреции особого химического соединения - медиатора, или нейромедиатора, который узнается белком-рецептором при­ нимающей сигнал клетки. Так, нервно-мышечный синапс передает возбуж­

дение в одном направлении: от нервного окончания к постсинаптической мембране мышечного волокна. Наиболее детально изученным нейромедиато­ ром в нервно-мышечном синапсе является ацетилхолин

СН„

c h 3-c -o -c h 2-c h 2-n -С Н 3

СН„

В нервно-мышечном синапсе в норме ацетилхолин действует на постсинаптическую мембрану всего в течение 1-2 мс, так как сразу же начинает раз­ рушаться ферментом ацетилхолинэстеразой, которая катализирует гидролиз сложноэфирной связи в ацетилхолине. Таким образом, в функционировании нервной системы принимают участие как минимум два фермента.

Важнейшие функции белков связаны с их действием в качестве рецепто­ ров. Рецепторами называют белки, вмонтированные в клеточную мембрану

испособные специфично связываться с определенными, поступающими из­ вне веществами. Это связывание вызывает конформационный переход, инду­ цирующий определенный ответ клетки, т. е. включает функционирование клетки. Например, рассмотренный выше ацетилхолин имеет свой рецептор, связывание с которым является первичным событием возбуждения воспри­ нимающей сигнал клетки.

Срецепторами связано функционирование гормонов, которое начинается

собразования комплекса гормона с рецептором. На мембране находятся

идругие группы рецепторов. Например, рост клеток стимулируется специ­ альными белками - факторами роста, каждый из которых имеет свои рецеп­ торы. Факторы роста также относятся к регуляторным белкам. Они были от­ крыты при изучении условий, необходимых для роста и дифференцировки клеток. Так, для образования нервных клеток необходимо участие фактора роста нервов (NGF, nerve growth factor). Факторы роста выделяются клетка­ ми той же ткани, к которой они принадлежат, взаимодействуют с наружным рецептором клетки и опосредованно влияют на инициацию транскрипции специфических генов. Факторы роста действуют в основном местно на близ­ лежащие клетки. К ним относятся, в частности, фактор роста эпидермиса

(EGF, epidermal growth factor), фактор роста тромбоцитов (PGF, platelet growth factor), различные факторы, необходимые для дифференцировки ство­ ловых клеток костного мозга. Были открыты и другие факторы, имеющие жизненно важное значение для развития клеток определенных типов и под­ держания их нормального существования.

Изучение факторов роста в основном связано с интересом к процессам клеточного деления, и особенно с изучением группы белков, программируе­ мых так называемыми протоонкогенами и участвующих в регуляции этих процессов. Измененные формы данных генов (онкогены) обнаруживаются

134Глава 6. Белки. Основные принципы строения и функции

вопухолевых клетках. В настоящее время открыто несколько десятков про­ тоонкогенов и соответствующих им онкогенов и показано, что продукты про­ тоонкогенов в здоровых клетках являются участниками передачи сигналов, управляющих митозами.

Событием, противодействующим неограниченному делению клеток, яв­

ляется апоптоз - программируемая клеточная смерть. Центральную роль в регуляции и протекании апоптоза играют специальные белки - каспазы.

Далеко не все белки должны сохраняться на протяжении жизни организ­ ма. У позвоночных существует специальный механизм для деградации «от­ служивших» белков. Этот механизм действует также в случае необходимости уничтожить поврежденные белки, для чего в организме вырабатывается спе­ циальный небольшой, построенный из 76 аминокислотных остатков белок убиквитин (от англ. ubiquitous - вездесущий). Он ковалентно связывается с белками, подлежащими удалению, и служит меткой для действия специаль­ ной разрушающей белки системы. Механизм выбора мишеней для убиквитинирования и направления модифицированных белков к разрушающей систе­ ме еще далек от установления.

6.2.3. Основные белки иммунной системы

Большую группу представляют белки, связанные с функционированием иммунной системы. Ее задачей является наблюдение за появлением в орга­ низме чужеродных биополимеров или клеток и их уничтожение. Иммунная система млекопитающих состоит из тимуса, селезенки и сети лимфатических узлов, соединенной с кровеносной системой. Элементами, которые осущест­ вляют иммунологическое наблюдение за организмом, являются специальные клетки иммунной системы - лимфоциты. Иммунная система обладает уни­ кальной способностью отвечать на появление чужеродных частиц выработ­ кой огромного числа лимфоцитов, способных специфически повреждать именно эти частицы. Такими частицами могут быть чужеродные клетки, на­ пример, патогенные бактерии; ошибочно измененные клетки организма, включая те, которые вызывают злокачественные новообразования; надмоле­ кулярные частицы, такие как вирусы; макромолекулы, в том числе чужерод­

с определенными участками чужеродных биополимеров или клеток, которые называют антигенными детерминантами.

Различают две основные группы лимфоцитов. Одна из них, так называе­ мые Т-лимфоциты, представляет собой популяцию лимфоцитов, производст­ во которых контролируется тимусом. Т-лимфоциты составляют порядка 70-80 % от общего числа лимфоцитов. На поверхности Т-лимфоцитов нахо­ дятся специальные рецепторы, предназначенные для специфического взаи­ модействия с чужеродными объектами. Они опознают антигенные детерми­ нанты только с участием еще одной группы белков, образующих так назы­

ваемый главный комплекс гистосовместимости {МНС, Major Histo­ compatibility Complex). Состав этого комплекса, как правило, различен не только для разных видов живых организмов, но и в пределах одного вида. Это, в частности, является серьезной преградой для пересадки органов, по­ скольку МНС донора и акцептора пересаживаемого органа, скорее всего, не­ идентичны, и Т-лимфоциты акцептора отторгают пересаженный орган через то или иное время после пересадки.

Вторая группа лимфоцитов - это В-лимфоциты, продуцирующие анти­ тела {иммуноглобулины) - белки, способные к высокоспецифичным взаимо­ действиям с чужеродными или собственными компонентами организма. Ан­ титела, как и Т-лимфоциты, узнают не целую молекулу или клетку, а какойто определенный его участок - антигенную детерминанту. Каждый В-лимфо- цит специфичен к одной определенной детерминанте и далее, размножаясь, образует клон одинаковых клеток. Число разнотипных клонов, а следовательно и число разнообразных антител, очень велико. Смесь выде­ ляемых антител называют поликлональными антителами. Разделить их на индивидуальные компоненты в общем случае не представляется возможным. Это, в частности, долгое время было непреодолимым препятствием на пути к установлению структуры антител. Важную роль для решения этой задачи сыграло исследование такого заболевания, как миелома, при котором проис­ ходит неограниченное разрастание одного клона и неограниченное производ­ ство одного определенного антитела, которое удается отделить от основной массы антител. Такие антитела получили название моноклональных антител. Исследование миеломных белков позволило установить общие принципы структуры антител.

Было установлено, что антитела состоят из четырех полипептидных цепей - двух легких и двух тяжелых. Эти полипептиды связаны между собой дисульфидными мостиками и нековалентными взаимодействиями. При мягком воздействии фермента папаина антитела расщепляются на два идентичных

Fab-фрагмента (antibody binding fragments), которые состоят из N-концевой половины тяжелой цепи и легкой цепи. Кроме того, образуется Fc-фрагмент, состоящий из двух идентичных С-концевых фрагментов, связанных дисульфидными мостиками. Каждая из этих полипептидных цепей имеет в составе иммуноглобулина определенную пространственную структуру, которая фор­ мируется у легких цепей из двух, а у тяжелых - из четырех достаточно авто­ номных структурных элементов {доменов). Оба типа цепей имеют с N-конца по одному домену, обеспечивающему специфическое взаимодействие с антигенной детерминантой. Поскольку разные антитела сформированы для узнавания различных антигенов, их структуры могут существенно различать­ ся, поэтому такие N-концевые участки называются вариабельными доменами. Они отличаются большим разнообразием первичной структуры. Общая структура антитела представлена на рис. 48.

Недостатком подхода к изучению структуры антител, основанного на ис­ пользовании миеломных белков, была практическая невозможность устано­

Присутствие определенного белка в анализируемой биологической жид­ кости или локализацию этого белка в клетке можно определить по образова­ нию комплекса антиген-антитело с помощью моноклонального антитела

кэтому белку.

6.2.4.Белковые факторы транскрипции и трансляции

Большая группа белков сопровождает процессы матричного биосинтеза. Их чаще всего также квалифицируют как факторы.

При репликации, помимо перечисленных в § 1.5 ферментов (ДНКполимеразы, ДНК лигазы и геликаз), необходимы дополнительные белки, выполняющие некаталитические функции. Поскольку после разделения ни­ тей до присоединения очередного остатка нуклеотида проходит определен­ ный интервал времени, необходимо предотвратить восстановление компле­ ментарных взаимодействий между разделенными фрагментами. Для этого в вилке репликации присутствует специальный белок, связывающийся с однонитевой ДНК (белок SSB, single-strand binding у прокариот и белок RPA, replication protein А у эукариот).

Важной характеристикой полимераз нуклеиновых кислот является процессивность их функционирования. После каждого акта присоединения оче­ редного мономера диссоциации комплекса фермент-ДНК не происходит, фермент остается связанным с матрицей, но перемещается относительно нее на одно нуклеотидное звено, которое в результате этого становится управляющим. Процессивность ДНК-полимеразы обеспечивается наличием специального зажима, окаймляющего комплекс фермента и матрицы. У эукариот роль тако­ го зажима играет белок PCNA (proliferation cell nuclear antigen). Посадка за­ жима на репликативный комплекс осуществляется с помощью специального пятисубъединичного белка RFC (replication factor С)

Разнообразную роль играют также факторы транскрипции. У эукариот РНК-полимеразы не узнают непосредственно промоторы, и их взаимодейст­ вие с промоторами опосредовано дополнительными белками, известными под общим названием факторов транскрипции. Именно эти факторы опреде­ ляют, с каких промоторов на данный период функционирования клетки будет проходить транскрипция определенных генов. Для каждой из трех РНКполимераз имеется свой набор факторов транскрипции, в связи с чем их обо­ значают TFI, TFII TFIII. Разные факторы, работающие с одной и той же по­ лимеразой, обозначают дополнительно большими латинскими буквами (на­ пример, TFIIA, TFIIB, TFIIC и т. д.).

Специальные факторы участвуют в процессах трансляции. У прокариот аминоацил-тРНК перед ее помещением в определенный участок трансли­ рующей рибосомы (A-сайт) аминоацил-тРНК связывается с фактором элон­ гации EF-1 (у прокариот фактор EF-Tu). С участием GTP образуется тройной комплекс EF-1 •GTP* аминоацил-тРНК, в составе которого происходит гидролиз GTP до GDP, сопровождающийся отщеплением фактора от рибосомы. В A-сайте происходит образование новой пептидной связи между

138Глава 6. Белки. Основные принципы строения и функции

ВA-сайте происходит образование новой пептидной связи между растущей полипептидной цепью и внесенной на рибосому аминоацил-тРНК. Для про­ должения роста цепи требуется освобождение A-сайта, что достигается пере­ мещением (транслокацией) образовавшейся пептидил-тРНК в P-сайт, катали­ зируемым фактором EF-2 (у прокариот EF-G). Фактор присоединяется к ри­ босоме в комплексе с GTP и после транслокации диссоциирует от рибосомы, предварительно осуществив гидролиз GTP до GDP.

6.2.5. Специальные функции белков

Белки являются необходимым компонентом большого спектра биополи­ меров, выполняющих высокоспециализированные функции. Например, в пе­ реносе кислорода от легких к различным тканям, потребляющим кислород, непосредственным переносчиком является гемоглобин - комплекс белка гло­ бина с гемом.

сн=сн2

Гемоглобин в составе специальных клеток - эритроцитов - обратимо при­ соединяет молекулы СЬ в легких, и далее эритроциты разносятся током крови к самым разнообразным тканям, потребляющим кислород для осуществления окислительных процессов. Важным переносчиком многих биологически зна­ чимых соединений, в первую очередь, жирных кислот, является основной белок плазмы крови - сывороточный альбумин.

Первичное восприятие электромагнитного излучения (света) в процессе зрения осуществляется с помощью родопсина, который представляет собой комплекс белка опсина с молекулами низкомолекулярного соединения ретиналя, описаного в § 2.1.

Большая группа белков представлена различными токсинами, которые функционируют в качестве ядовитых компонентов многих животных: ядови­ тых змей, скорпионов, пчел, ос и ряда других животных.

В живых организмах полипептидные цепи синтезируются по единому ме­ ханизму. В этом процессе важнейшую роль играют нуклеиновые кислоты, данный вопрос рассматривался в § 1.3.

Важную роль играют некоторые белки в качестве структурных компонен­ тов. К ним относятся, например, один из основных белков соединительной ткани коллаген или фиброин шелка, формирующий оболочку куколки тутово­ го шелкопряда. Цитоскелет, присущий эукариотическим клеткам, формиру­ ется такими белками, как актин и тубулин. Однако рассмотрение этих белков

восновном является предметом биологической химии, и его можно найти

вкурсах по биохимии.

Как было видно на примере моноклональных антител, определенные группы белков стали важными инструментами тонких биологических иссле­ дований. В качестве еще одного примера можно привести сравнительно не­ давно вошедшие в практику биохимических и цитологических исследований цветные флуоресцирующие белки. Первым из них был зеленый флуоресци­ рующий белок (GFP, green fluoresent protein из медузы Aequorea victoria).

Главный максимум спектра возбуждения флуоресценции этого белка распо­ ложен при 395 нм, а спектр флуоресценции при облучении белка имеет мак­ симум 508 нм. Хромофор (т. е. радикал, обеспечивающий интенсивную окра­ ску) этого белка имеет строение

где цифры обозначают положение аминокислотных остатков в полипептидной цепи, из которых образуется хромофор. Второй детально изученный бе­ лок этого класса - белок drFP583, выделенный из кораллов Discosoma, обла­ дающий красной флуоресценцией с максимумом при 583 нм. Его хромофор сформирован в результате посттрансляционной модификации белка по остат­ кам трипептида Gln66-Tyr67-Gly68.

Методы генетической инженерии позволяют сегодня создавать в ряде случаев белки, содержащие одновременно последовательности аминокислот белка GFP и какого-либо функционально значимого белка (например, участ­ вующего в транспорте компонентов живого организма) с сохранением биоло­ гической активности последнего и флуоресцентных свойств GFP. Такие кон­ струкции называют химерными белками. С их помощью можно следить за локализацией белка и его перемещением в клетке или в организме по поло­ жению флуоресцентной метки.