КНОРРЕ_3227

торых случаях большем) расщеплений белка по двум точкам, отличающимся по природе аминокислотных остатков. Суть метода проще всего уяснить на конкретных методах расщепления, допустим, на примере расщеплений с по­ мощью трипсина и химотрипсина. Если два пептида, получившиеся в резуль­ тате специфического расщепления трипсином (Т-пептиды), были соседними в анализируемом белке, то среди пептидов, полученных расщеплением с по­ мощью химотрипсина (С-пептид), должен находиться такой, N-конец кото­ рого совпадает с С-концом одного из двух соседствующих Т-пептидов, а С-конец этого С-пептида - с N-концом второго Т-пептида. Иными словами, два соседствующих Т-пептида полностью перекрываются каким-либо С-пеп- тидом. Аналогично два любых соседствующих С-пептида перекрываются каким-либо Т-пептидом. При установленных первичных структурах не пред­ ставляет труда вручную установить все перекрываемые пары, т. е. восстано­ вить всю первичную структуру белка или каждой из его субъединиц.

В качестве иллюстрации как самого подхода, так и возникающих ослож­ нений, на рис. 62 приводится пример установления порядка расположения двух пептидов трипсинового гидролизата белка ТВР человека, первичная структура которого приведена на рис. 65 в § 8.3.

Рис. 62. Первичные структуры двух пептидов трипсинового гидролизата ТАТАбокссвязывающего белка человека - а; структура перекрывающего их пептида химотрипсинового гидролизата того же белка - б; первичные структуры пептидов того же трипсинового гидролизата с лейцином на N-конце - в (в однобуквенном пред­ ставлении)

Из приведенных структур двух Т-пептидов (рис. 62, а) следует, что они являются соседями в белке, поскольку они перекрываются приведенным под ними пептидом химотрипсинового гидролизата (рис. 62, б). В то же время для продолжения расстановки пептидов недостаточно найти среди Т-пепти- дов продолжающий справа второй из представленных, поскольку он должен начинаться с лейцина, а таких Т-пептидов в трипсиновом гидролизате четыре (рис. 62, в). Чтобы выбрать из них тот, который примыкает ко второму Т-пеп- тиду, необходимо провести еще одно специфическое расщепление по участ­ ку, не совпадающему с расщеплением трипсином и химотрипсином.

§ 8.2. Секвенирование пептидов. Метод Эдмана. MS/MS-секвенирование 181

§ 8.2. Секвенирование пептидов. Метод Эдмана. MS/MS-секвенирование

Чисто химический подход к секвенированию пептидов был разработан Эдманом (P. V. Edman), и метод носит его имя. Метод основан на реакции N-концевой а-аминогруппы с фенилизотиоцианатом, приводящей к превра­ щению N-концевого аминоацильного остатка в N-фенилтиокарбамоильное производное, которое отщепляется в виде 2-анилино-5-тиазолинона с осво­ бождением пептида, укороченного на один аминокислотный остаток. Тиоазолинон при подкислении превращается в фенилтиогидантоин, соответст­ вующий отщепленной N-концевой аминокислоте. Ниже приводится схема этого многостадийного процесса.

Фенилтиогидантоины обладают интенсивным УФ-поглощением (моляр­ ные экстинкции от 12654 М''см'' для производного гистидина до 30224 М''см'' для производного аланина). Поскольку свойства фенилтиогидантоинов с раз­ личными радикалами R отличаются в соответствующим образом подобран­ ных хроматографических системах, можно идентифицировать фенилтиоги­ дантоин, а следовательно и отщепленную аминокислоту. Для большинства аминокислотных остатков удобным методом идентификации является массспектрометрический. Проведение ступенчатого отщепления N-концевых аминокислотных остатков и их идентификация через идентификацию обра­ зующихся фенилтиогидантоинов позволяет установить последовательность этих остатков в анализируемом пептиде. При тщательном проведении каж­ дой стадии и использовании высокоочищенных реактивов можно установить последовательность до 30 аминокислотных остатков.

Помимо фенилизотиоцианата, для аналогичной процедуры предложены и некоторые другие изотиоцианаты. Так, для повышения чувствительности метода вместо фенилизотиоцианата предложено использовать диметилами- ноазобензол-4’-изотиоцианат (ДАБИТЦ).

182 Глава 8. Первичная структура пептидов и белков

При этом образуются окрашенные аминокислотные производные 4-диме-

реакционноспособен в отношении TV-концевых аминогрупп. Поэтому в каж­ дом цикле после его реакции с полипептидом для полного израсходования N-концевых а-аминогрупп приходится проводить дополнительную реакцию с более эффективно реагирующим фенилизотиоцианатом. Получающиеся З-фенил-2-тиогидантоинаминокислоты бесцветны и не мешают идентифика­ ции окрашенных тиогидантоинов. Кроме этого, ограничением для широкого распространения 4-диметиламиноазобензол-4’-изотиоцианата является его нестабильность при хранении.

Специфической особенностью секвенирования пептидов по Эдману явля­ ется огромное число идентичных по типу реакции стадий, которые необхо­ димо проводить на каждом этапе укорочения пептидной цепи. Методологи­ чески эта ситуация аналогична рассмотренной ранее применительно к многоступенчатому синтезу олигонуклеотидов, и целесообразна автомати­ зация процесса. Поэтому созданы специальные приборы для автоматического секвенирования по методу Эдмана (автоматические секвенаторы белков). В секвенаторах анализируемый полипептид ковалентно связан с нераствори­ мым носителем и через колонку с анализируемым пептидом по заданной программе последовательно пропускаются раствор фенилизотиоцианата, рас­ творитель для отмывки от избытка реагента, раствор CF3COOH для превра­ щения N-концевого остатка в фенилтиогидантоин и его отщепления от им­ мобилизованного пептида, последующее определение природы отщепивше­ гося остатка и продолжения секвенирования.

В качестве нерастворимого носителя обычно используются полимерные материалы, несущие алифатические аминогруппы, с которыми связываются концевые карбоксильные группы секвенируемого белка или полипептида - производные сополимера стирола и дивинилбензола или стекло, несущее аминопропильные остатки. Фрагменты анализируемого белка, полученные гидролизом белка специфическими протеазами, имеют на С-конце карбок­ сильную группу. Присоединение таких пептидов к аминогруппам можно осуществить с помощью карбодиимида. Чтобы избежать выпадение на носи­ теле дициклогексилмочевины, используют водорастворимые карбодиимиды, например, Л^-(3-диметиламино)-А^’-этоксипропилкарбодиимид. При этом од­ новременно активируются карбоксильные группы остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, что неизбежно приведет к иммобилизации пептида по этим группам. Это не позволило бы проводить процедуру Эдмана после первого же остатка одной из дикарбоновых аминокислот. Избежать такого процесса можно предварительным выдерживанием пептида с карбодиимидом. При этом С-концевая группа превращается в оксазолон, который спосо­ бен ацилировать аминогруппы носителя, а активированные СООН-группы

§ 8.2. Секвенирование пептидов. Метод Эдмана. MS/MS-секвенирование 183

дикарбоновых кислот переходят в неактивные производные N-ацил- мочевины. Схема процесса приведена на рис. 63.

+ X -N H -C -N H -X '

м

О

Рис. 63. Получение С-концевого оксазолона

При использовании бромцианового расщепления белка по остаткам ме­ тионина, как видно из рис. 63, получаются пептиды с С-концевым оксазолоном, которые можно непосредственно присоединять к аминогруппам носителя.

В настоящее время интенсивное развитие приобрел масс-спектрометри- ческий метод определения последовательности аминокислот в пептидах. Он основан на масс-спектрометрическом анализе смеси пептидов, образованных при специфическом гидролизе анализируемого белка. Молекулярные ионы пептидов, имеющие одинаковую массу, аккумулируются в ионном источнике масс-спектрометра, где подвергаются фрагментации и затем повторному масс-спектрометрическому разделению. В связи с двукратным массспектрометрическим разделением такой метод установления первичной структуры принято называть MS/MS-секвенированием (этот подход часто обозначают как секвенирование de novo).

Главным принципом при этом подходе к MS/MS-секвенированию являет­ ся сравнение масс фрагментов, полученных в результате однократного раз­ рыва анализируемого пептида при его фрагментации в ионном источнике масс-спектрометра. При фрагментации главным образом разрушается пеп­ тидная связь. В результате образуются Ь,- и у,-фрагменты, содержащие N-ko- нец или С-конец пептида соответственно. Индекс i означает число аминокис­ лотных остатков во фрагменте. Наряду с этим в ряде случаев образуются ос­ колки, получившиеся в результате разрыва связи CHR-CO, которые также содержат либо N-конец, либо С-конец пептида. Их обозначают как а, и х, со­ ответственно. Осколки а, и Ь, различаются на массу СО-группы (28). Наличие в спектре пар линий с такой разницей позволяет вычленить из множества ли­

каждой пептидной связи. Кроме того, образование ионов при расщеплении пептидов может сопровождаться разрушением боковых радикалов. Так, ос­ татки аргинина, лизина, глутамина и аспарагина могут терять молекулу ам­ миака, что приводит к уменьшению массы на 17 единиц. Остатки серина, треонина и глутамата могут терять молекулу воды, что приводит к уменьше­ нию массы фрагментов на 18 единиц.

Установление природы всех аминокислотных остатков означает и уста­ новление последовательности аминокислот в пептиде. Достоинством MS/MSсеквенирования по сравнению с секвенированием по Эдману является значи­ тельное снижение времени секвенирования и возможность оперировать с су­ щественно меньшим количеством образца - фемтомоли вместо пикомолей, необходимых для метода Эдмана.

§8.3. Банки данных для последовательностей аминокислот в белках

Внастоящее время накоплено огромное количество данных о последова­ тельности аминокислотных остатков в белках (т. е. о первичных структурах белков). Они собраны в специальных банках данных, и для каждого из секвенированных белков эти последовательности могут быть извлечены на персо­ нальный компьютер через систему Интернет. Аминокислотные последова­ тельности являются вторым важным источником биологической информа­ ции. Данные о последовательностях белков содержатся также в базе данных

Genbank (см. § 3.5).

Кроме первичной структуры, в банке приводится экспертная (вводимая специальным экспертом) информация о белке, которая содержит сведения

офункции белка (в случае ферментов - данные о кофакторах, метаболиче­ ских путях, механизмах регуляции), о биологически важных доменах и сай­ тах; о вариантах постгрансляционной модификации; о молекулярной массе по данным масс-спектрометрии; о внутриклеточной локализации; тканеспе­ цифичной экспрессии белка и ее зависимости от стадии развития; данные по разметке вторичной структуры белка (в случае, если она известна на основа­ нии структурных данных); данные о четвертичной структуре, об участии во взаимодействиях с различными биологически значимыми молекулами и ио­ нами и ряд других сведений.

Для того, чтобы получить информацию об интересующей нас аминокис­ лотной последовательности, нужно зайти на сайт http://www.ncbi.nclm.nih.gov/Genbank/. В открывающемся окне во вкладке

«Search» теперь выбрать «protein» и рядом с ней окно, в которое надо ввести название искомого объекта, например, TATA-box binding protein AND Human[Organism], нажать «Enter»/KHonKy «Go». В появившемся окне из таб­ лички с описанием выбрать интересующую последовательность (например, TBP HUMAN), напротив нее в поле Accession (доступ) нажать гиперссылку

(в нашем случае это Р20226Ч - открывается окно с наиболее полной на дан­ ный момент информацией об этой последовательности в выбранном орга­ низме: откуда, где находится, ссылки на соответствующую литературу, все свойства и модификации данной последовательности, известные на настоя­ щий момент, и сама последовательность.

В качестве примера на рис. 65 в оригинале приведен фрагмент из Генбанка, полученного для участвующего в инициации транскрипции белка ТВР.

Protein names: Recommended name: TATA-box-binding protein Organism: Homo sapiens (Human)

Function: General transcription factor that functions at the core of the DNAbinding multiprotein factor TFIID. Binding of TFIID to the TATA box is the ini­ tial transcriptional step of the pre-initiation complex (PIC), playing a role in the activation of eukaryotic genes transcribed by RNA polymerase П.

Involvement in disease: Defects in TBP are the cause of spinocerebellar ataxia type 17 ГМ1М:6071361. Spinocerebellar ataxia is a clinically and genetically heterogeneous group of cerebellar disorders. Patients show progressive incoordina­ tion of gait and often poor coordination of hands, speech and eye movements, due to degeneration of the cerebellum.

Sequence:

Рис. 65. Последовательность аминокислот человеческого белка ТВР вместе с вы­ боркой го экспертной информации (данные Genbank)

На этой последовательности авторы выделили жирным шрифтом (в дан­ ных Генбанка этого выделения, естественно, нет) фрагменты, полученные трипсиновым гидролизом, имеющие на N-конце остаток лейцина и использо­ ванные в § 8.1 для иллюстрации метода перекрывающихся блоков. Исключи­ тельно в целях иллюстрации приведена лишь малая часть выборки из экс­ пертных данных.

Глава 9. Пространственная структура белков

§9.1. Вторичная, третичная и доменная структура белков

9.1.1.Глобулярные белки. Формирование их пространственной струк­ туры. Шапероны. Прионы

В функционировании белков решающее значение имеет их пространст­ венная структура. По типам пространственных структур белки разделяют на глобулярные и фибриллярные.

Подавляющее большинство наиболее тонких функций выполняется гло­ булярными белками. Они имеют уникальную объемную структуру, в которой аминокислотные остатки с гидрофобными боковыми радикалами в основном сосредоточены во внутренней части молекулы, а гидрофильные, в том числе несущие электрический заряд остатки, располагаются преимущественно на поверхности глобулы. В частности, снаружи формируются активные центры ферментов, которые взаимодействуют с соответствующими субстратами, аллостерическими эффекторами и кофакторами. Способная к функционирова­ нию пространственная структура белка часто называется нативной структу­ рой, или нативной конформацией.

Глобулярная структура легко разрушается при повышении температуры, при добавлении органических растворителей или воздействии других небла­ гоприятных факторов. Процессы, приводящие к разрушению пространствен­ ной структуры, называются денатурацией белка. К денатурирующим агентам относятся и такие вещества, как мочевина и гуанидин, замещающие молеку­ лы воды в сольватной оболочке белка. Восстановление пространственной структуры называется ренатурацией.

Пространственная структура белка, скорее всего, формируется по ходу трансляции. Хотя эта структура предопределяется последовательностью аминокислот, образование ее из развернутой полипептидной цепи, в особен­ ности для достаточно протяженных пептидных цепей, не происходит само­ произвольно. В этом процессе принимают участие белки, получившие назва­ ние шапероны. Они были впервые обнаружены у дрозофилы, подвергнутой действию повышенной температуры, и получили название белков теплового шока (белки Hsp, heat shock proteins). Такие белки в настоящее время обна­ ружены у самых разнообразных живых организмов. В этом случае их роль состоит в предотвращении денатурации белков путем их взаимодействия с частично или полностью денатурированными белками. По-видимому, узна­ вание поврежденных белков шаперонами в значительной мере обусловлено

Вокруг обеих связей, образуемых каждым атомом Са, возможно затормо­ женное вращение, и соответствующие торсионные углы обозначают буквами <р для связи C“-N и V)/ для связи С“-С’ Именно эти два угла характеризуют ход полипептидной цепи в пространстве. Из сказанного следует, что полипептидную цепь можно представить как серию связанных между собой пло­ ских фрагментов, соединенных между собой хиральными атомами С“ (см.

рис. 66).

9.1.2. Вторичная структура белков. а-Спирали и 0-складки

Если на протяжении некоторого участка полипептидной цепи все углы ср имеют близкие значения между собой и то же самое имеет место для углов ц/, то структура полипептидной цепи приобретает периодический характер. Такие регулярные элементы пространственной структуры называют вторич­ ной структурой белка. В белках широко представлены два типа таких пе­ риодических структур - а-спирапи и Р-складки.

Спиральной является структура, у которой все однотипные атомы распо­ ложены на одной винтовой линии. При этом спираль считается правой, если при наблюдении вдоль ее оси она удаляется по часовой стрелке. В противо­ положной ситуации (удаляется от наблюдателя против часовой стрелки) спираль считается левой (рис. 67).

Рис. 67. Схематическое изображение спирали: Н - шаг спирали; г - радиус; а - правая спираль; б - левая спираль

В спиральной пептидной цепи на одной винтовой линии находятся все хиральные атомы Са, на другой - все атомы N, на третьей - все атомы С’ При этом для всех групп атомов должен быть один и тот же шаг спирали Н