КНОРРЕ_3227
.pdf260_________ Глава 12. Специфические взаимодействия биополимеров
Трифосфатную группу можно превратить в реакционноспособную цик лическую триметафосфатную обработкой карбодиимидами.
|
|
|
|
|
-о |
,о |
|
|
|
^ |
^ |
|
о |
|
0 = Р Х |
I |
о |
о |
Ade |
- 0 - Р - 0 - Р - 0 - Р - 0 - л / ° \ . А а е |
|
|
|
|
|||||
О* |
О - O ’ |
\ |
I + |
X-N=C=N-X’ ---------► |
Q - 0 |
4 О |
\ |
|
/ |
|
|
НО |
ОН |
|
|
|
НО |
|
ОН |
Аденозин-5’-триметафосфат может служить аффинным реагентом, моде лирующим АТР и способным осуществлять аффинное фосфорилирование аминогрупп остатков лизина в центре связывания.
Если трифосфатная группа АТР не имеет определяющего значения при взаимодействии АТР с биополимером, можно заменить ее на п- фторсульфонилбензоильный остаток. Производные аденозина и гуанозина, несущие такой остаток вместо трифосфатной группы, нашли широкое при менение для аффинной модификации белков, одним из субстратов или эф фектором которых является АТР или GTP.
НО ОН
При проведении аффинной модификации не всегда удается полностью исключить параллельную неспецифическую модификацию каких-либо дру гих остатков. При модификации фермента присоединение остатка реагента может произойти вне активного центра фермента. Для того, чтобы выявить аминокислотный остаток в белке, модифицированный в активном центре, М. А. Грачевым с соавторами (Лимнологический институт СО РАН) был предложен подход, названный ими сверхселективным мечением. Основную методологию этого подхода можно проиллюстрировать работой авторов по сверхселективной модификации РНК-полимеразы. Для модификации исполь зовали производное тринуклеотида XpdCpdGprC, где X - остаток N-метил- имидазола. На первой стадии фермент модифицировали нерадиоактивным реагентом. Затем в реакционную смесь вводился [а-Р32] UTP. Та часть три нуклеотида, которая оказалась в районе активного центра фермента, элонгировалась и становилась меченой. Тринуклеотиды, оказавшиеся не в активном центре, элонгации не подвергались и оставались немечеными. Метка в этом
§ 12.2. Аффинная модификация биополимеров |
261 |
случае была обнаружена в р-субъединице фермента и идентифицирована как связанная с остатком лизина. Схема сверхселективного мечения приведена на рис. 80. Из приведенного описания видно, что предложенный метод предпо лагает возможность проведения двухстадийного процесса и что аффинная модификация не лишает фермент каталитической активности.
;r-A-C-A-A-A-T-C-G-C-T4
—A-G-Ax |
A-G-G— |
—Т-С-Тч |
/Т -С -С - |
у ш |
А-Т-G-Т-Т-T-A-G-C-G-A |
f-C-G-C |
/T-A-C-A-A-A-T-C-G-C-Ts
-A-G-A |
A-G-G— |
-Т-С-Тч |
/Т -С -С - |
ш |
A-T-G-T-T-T-A-G-C-G-A |
-C-G-C |
|
Т_Г |
|
C-G-C |
|
|
pppU |
/T-A-C-A-A-A-T-C-G-C-T4 |
|
-A-G-A |
A-G-G— |
-Т-С-Тч |
/ Т-С-С- |
|
А-Т-G-Т-Т-Т-A-G-C-G-A |
^ |
j —C-G-CpU |
LE |
C-G-C |
|
|
L-C-G-C
Рис. 80. Схема сверхселективного мечения РНК-полимеразы. Заштрихованный многоугольник Е - фермент. Звездочкой отмечен меченый остаток уридина. Черной шляпкой отмечены точки ковалентного связывания реагента с ферментом
После проведения аффинной модификации белков интересно установить, по какому аминокислотному остатку прошла модификация. Естественно, что выявление точек модификации имеет смысл проводить с белком, первичная структура которого известна. Обычно эта задача решается в два этапа. На первом этапе одним из методов, рассмотренных в § 8.1, проводится специфи ческое расщепление модифицированного белка на фрагменты и устанавлива ется, в каком из полученных пептидов находится модифицированный оста
262_________ Глава 12. Специфические взаимодействия биополимеров
ток. Если модификация проводилась с использованием радиоактивного реа гента, то дальнейшему исследованию подлежит тот пептид, который оказал ся радиоактивным. Выявить модифицированный пептид можно также массспектрометрическим анализом. Ожидаемые массы всех образующихся при специфическом расщеплении белка пептидов естественно легко вычисляют ся, и в спектре масс довольно просто выявить измененный при модификации пептид.
Поскольку химические свойства аффинного реагента известны, то можно определить, какие из аминокислотных остатков могли быть модифицирова ны. Если такой остаток является единственным, то можно считать, что задача решена. Если же модификация могла пройти по одному из нескольких спо собных к реакции остатков, то необходимо дальнейшее исследование моди фицированного пептида. Это можно, в частности, сделать методом Эдмана (см. § 8.2). При использовании такой пошаговой процедуры при достижении модифицированного остатка расщепление по Эдману либо вообще не про изойдет, либо получится аномальный, несвойственный никакой природной аминокислоте фенилтиогидантоин.
Своеобразным типом аффинной модификация является модификация ферментов реагентами-самоубийцами (suicide substrates). Эти реагенты, об ладающие сродством к некоторому ферменту, сами по себе не обладают ре акционной способностью, но под действием фермента переходят в химиче ски активное соединение, которое может аффинно модифицировать фермент.
Вкачестве примера можно привести один из ферментов, участвующих
всинтезе жирных кислот, - дегидратазу (3-гидроксиацилтиоловых эфиров, катализирующую реакцию
О
п
R-CH=CH-CH2-C-SR'
ОН
Поскольку на стадии изомеризации фермент осуществляет удаление про тона от атома С, примыкающего к карбонильному атому углерода, он может осуществлять такой же процесс с атомом С (3, у-ацетиленовых тиоэфиров, в результате чего ацетиленовая связь изомеризуется в алленовый фрагмент.
о |
о |
II |
II |
Последний обладает апкилирующими свойствами и может модифициро вать имидазольное кольцо остатка гистидина в активном центре фермента и тем самым инактивировать фермент.
§ 12.2. Аффинная модификация биополимеров |
263 |
Схема аффинной модификации в простейшем случае может быть записа на в виде
Р + X о Р Х -> PZ(KX,k ),
где Р - модифицируемый биополимер, X - аффинный реагент, РХ - их ком плекс, PZ - продукт аффинной модификации, Кх- константа ассоциации ми шени и реагента, к - константа скорости внутрикомплексной реакции.
Равновесие, характеризуемое константой ассоциации
К ’ ~ Ш \
и уравнение материального баланса
p , = \ p }+[p x ]+[p z \
где р 0- полная концентрация модифицируемого фермента,
позволяют записать уравнение для кинетики накопления продукта в виде
d\PZ] k K \x \p , - \P Z ^
dt 1+к.М
Следовательно, из данных по кинетике накопления PZ при нескольких концентрациях компонентов реакции можно определить параметры к и КХ9 характеризующие скорость внутрикомплексной реакции и сродство аффин ного реагента к мишени. Если реагент берется в достаточном избытке, то [X] можно заменить на начальную концентрацию реагента *0, и уравнение пре вращается в кинетическое уравнение реакции первого порядка с кажущейся константой скорости ккш:
КаЖ = кК хХ0(\ + К хХ0).
В присутствии природного лиганда или его структурного аналога Y аф финная модификация либо вообще не происходит, либо существенно замед ляется, при этом Y является конкурентом по отношению к аффинному реа генту. В этом случае схему аффинной модификации для простейшего случая следует дополнить обратимой реакцией
P + Y < ^ P Y {K y\
264 |
Глава 12. Специфические взаимодействия биополимеров |
Тогда выражение для ккшпринимает вид
кКххо
1 + K xx0 + K yy 0 ,
где у0 - концентрация конкурирующего реагента.
Для реакции первого порядка выражение для концентрации PZ как функ ции времени имеет очень простой вид:
[PZ] = х0(l - exp"*™*')
и из кинетических кривых для накопления PZ легко определяется ккаж, а из зависимости последней от х0, при наличии конкурента также от у 0, легко оп ределяются соответствующие константы ассоциации.
Применение аффинной модификации способствовало пониманию меха низма функционирования рибосом. Главный химический процесс, происхо дящий на рибосомах, - это образование новых пептидных связей. Растущая полипептидная цепь при этом связана с одной молекулой тРНК, а очередной вступающий в образование новой пептидной связи аминоацильный остаток - с другой молекулой тРНК. Этот процесс может быть записан в виде
XCHRfCO-...-NHCHR,CO-tRNA('} + NH3+CHR/+JCO-tRNA('+,)
XCHR,CO-...-NHCHR,CO-NHCHR,+,CO-tRNA('+,) + tRNAw,
где X = H при синтезе у эукариот, и X = НСО у прокариот.
Участвующие в этом процессе две молекулы тРНК связаны нековалентно, но специфично со специальными участками рибосомы, обозначаемыми для пептидил-тРНК как P-сайт, а для аминоацил-тРНК как A-сайт. Освободив шаяся от аминокислотного остатка тРНК, по-видимому, еще остается в кон такте с рибосомой в выходном Е-сайте. Отбор очередной аминоацил-тРНК для удлинения полипептидной цепи происходит при участии соответствую щего кодона мРНК, и следовательно часть мРНК должна находиться в кон такте с рибосомой.
Отбор очередной молекулы аминоцил-тРНК происходит с участием спе циального белкового фактора элонгации EF-1, с которым связана молекула GTP (у прокариот этот фактор называют Ти). Отбор начинается с образова ния комплекса рибосома мРНК аминоацил-тРНК-EF-l-GTP. Комплекс обес печивает посадку аминоцил-тРНК в области A-сайта, причем этот процесс сопровождается гидролизом GTP до GDP и отщеплением EF-1-GDP от ком плекса. После этого происходит перенос пептидного остатка на новую ами
§ 12.2. Аффинная модификация биополимеров____________265
нокислоту с освобождением в свободном виде тРНК, которая перед этим бы ла связана с пептидом. Однако при этом тРНК, несущая удлиненный пептид, остается в A-сайте, и для продолжения процесса необходимо ее перемещение вместе со связанным с нею кодоном в Р-сайт (транслокация). Это происхо дит с участием еще одного белкового фактора, EF-2 (в случае прокариот его называют фактором G), который также функционирует в виде комплекса EF- 2-GTP. Транслокация сопровождается гидролизом GTP и отщеплением EF- 2-GDP от рибосомы. Таким образом, рибосома на разных стадиях трансляции специфично взаимодействует с молекулами тРНК в А-, Р- и Е-сайтах, с мРНК, с факторами трансляции. Для установления механизма трансляции необходимо установить, с какими фрагментами рибосомной РНК и с какими рибосомными белками взаимодействуют перечисленные участники трансля ции. Аффинная модификация позволяет локализовать все эти взаимодействия на разных этапах образования новой пептидной связи.
В качестве иллюстрации можно привести данные по локализации взаи модействий мРНК с рибосомами. Эти данные являются результатом система тических исследований, проводимых на рибосомах человека в лабораториях Г. Г. Карповой и А. Г. Веньяминовой в ИХБФМ СО РАН. Для аффинной мо дификации использовали синтетические олигорибонуклеотиды, в определен ные участки которых вводился фотоактивный нуклеотид: U или G с введен ной через спейсер соответственно по атому С5 и С7 фотоактивной тетрафторфенилазидогруппой.
На рис. 81 схематично приведены комплексы, в составе которых прово дилась аффинная модификация реагентами на основе гексануклеотида UUUGUU, в один из первых четырех нуклеотидов которого вводилась фотоактивная группа. Комплексы подвергались УФ-облучению, после чего из них выделялась рибосомная РНК и определялось положение модифицированного нуклеотида (природа и номер в цепи рРНК). Идентифицировались также ри-
266 |
Глава 12. Специфические взаимодействия биополимеров |
босомные белки, подвергавшиеся модификации. В комплексе (1) модифици ровался нуклеотид G-1207, в комплексе (2) - G-961, в комплексе (3) - нук леотиды А-1823 - А-1825. Из белков в наибольшей степени модифицирова лись в комплексе (1) S3 и S26, в комплексе (4) - S15.
Рис. 81. Комплексы, в составе которых проводилась аффинная модификация реа гентами на основе гексануклеотида UUUGUU. Ломаной линией символически изо бражена тРНК, расположенная в P-сайте. На вершине подписана связанная с ее акцепторым концом аминокислота. Прямоугольником обведены нуклеотидные остатки, несущие фотоактивную группу
Приведенные, а также значительное число других данных, полученных в тех же коллективах, позволили им представить модель размещения мРНК на малой субъединице (рис. 82).
268 |
Глава 12. Специфические взаимодействия биополимеров |
или нуклеиновых кислот. Антисмысловые олигонуклеотиды могут действо вать на однонитевые нуклеиновые кислоты, т. е. мРНК, и на содержащие РНК или однонитевую ДНК вирусы. Первой работой, в которой был проде монстрирован антисмысловой эффект олигонуклеотидов на биологический объект, была опубликованная в 1978 году статья американских ученых Замечника и Стефенсона, которым удалось подавить с помощью антисмысловых олигонуклеотидов развитие в культуре клеток РНК-содержащего вируса саркомы Рауса. И вскоре после этого стали возникать, первоначально в Рос сии, США и во Франции, группы исследователей, посвятившие свою дея тельность антисмысловой технологии.
Естественно, что возможность подавить проявление некоторой информа ции в живых организмах сулит огромные перспективы, прежде всего для ме дицинской практики. Во-первых, как и было показано на саркоме Рауса, ан тисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для подавления раз множения РНК-содержащих вирусов в клетках. Это открывает путь к созда нию противовирусных препаратов. Во-вторых, их можно использовать для подавления экспрессии онкогенов. Возникновение злокачественных опухо лей в значительной мере связано с появлением в отдельных нормальных клетках измененных генов, ответственных за регуляцию роста клеток и поте рявших способность осуществлять эту регуляцию в результате некоторой мутации. Потеря способности к этой регуляции приводит к неконтролируе мому размножению клеток, т. е. к возникновению опухоли. Соответствую щие нормальные гены называют протоонкогенами, а мутировавшие гены, способствующие возникновению злокачественных опухолей, - онкогенами. Это открывает возможность создания на основе антисенс олигонуклеотидов противоопухолевых препаратов.
С точки зрения практического использования антисмысловых олигонук леотидов особенно существенны две главные особенности таких препаратов:
1)любые олигонуклеотиды могут быть получены по единой технологии, т. е.
вслучае реализации этого принципа фактически можно организовать произ водство, пригодное для создания любых противовирусных и противоопухо левых препаратов; 2) в случае приспособления вируса или опухоли путем мутаций к воздействию определенного антисмыслового олигонуклеотида достаточно установить природу этой мутации и синтезировать антисмысло вой олигонуклеотид к мутировавшему вирусу.
Одним из первых вопросов, вставших при развитии антисмысловой тех нологии, было исследование возможности повысить эффективность модифи кации путем упрочнения дуплексов, образуемых реагентами и мишенью. Первоначально этого удалось достичь присоединением к олигонуклеотиду полиароматических радикалов, которые за счет стекинга или других некова
лентных взаимодействий повышали прочность дуплексов. Как описано в §4.1, удобным критерием прочности дуплекса является его температура плавления. Первые исследования этого рода были выполнены во Франции
§ 12.3. Антисмысловые нуклеиновые кислоты и их аналоги |
269 |
группой Клода Элена, который получил олигонуклеотиды с присоединенны ми остатками 2-метокси-6-хлор-9-аминоакридина. Уже на примере олиготимидилатов было показано, что имеет место существенная стабилизация ком плексов с комплементарной полиадениловой кислотой. В Новосибирском институте биоорганической химии для этой цели были использованы остатки феназиния.
Использование комплементарно-адресованной модификации открывало перспективу воздействия только на однонитевые нуклеиновые кислоты, т. е. на информационные РНК и на содержащие однонитевые ДНК вирусы. Одна ко принципиально существует возможность антисмыслового воздействия на ДНК при наличии достаточно протяженных полипуриновых/полипиримидиновых последовательностей. Как описано в § 4.1, в этом случае возмож но образование трехнитевых структур, что должно подавить функцию этого фрагмента ДНК. Действие на ДНК можно рассматривать как действие на ге ны, в связи с чем подход получил название антигенного воздействия, хотя это привело к смешению двух совершенно разнородных понятий - «антиген ного воздействия» и «антиген» в иммунологии. В качестве примера экспери ментального исследования, проведенного с целью антигенного воздействия на ДНК, можно привести воздействие олигопиримидина, построенного из 2’- аминоэтоксипиридиновых нуклеотидов, с участком ДНК клеток, специфично взаимодействующих с промотором РНК, программирующей синтез имму ноглобулина IgE. Ниже приведены структуры этого участка и использован ного олигонуклеотида
(5’)...-СрСрАрАрG p АрАрСрАрG p АрGp АрG p АрАрАрАрG-...(3’) (3’)...- G p G p T p T p C p T p T p G p T p C p T p C p T p C p T p T p T p T p C - . ..(5’)
(5’)рТрТрСрТрТрСрТрСрТрСрТрСрТрТрТр(3’)
Приведенный дуплекс специфично связывает фактор транскрипции STAT6, ответственный за активацию транскрипции. При достаточной кон центрации антигенного олигонуклеотида это связывание практически полно стью подавлялось, в то время как в присутствии другого пиримидинового олигонуклеотида с несоответствующей мишени последовательностью такого эффекта не наблюдалось.