КНОРРЕ_3227

разуется в матриксе в результате окисления ряда органических соединений, в первую очередь глюкозы и жирных кислот. Окислителем в комплексе I яв­ ляется убихинон (кофермент Q, см. гл. 18), далее обозначаемый как Q (в окисленном состоянии). Суммарное уравнение реакции:

NADH + Q + Н+ -» NAD + QH2

В комплексе III восстановленный кофермент Q окисляется цитохромом с (в окисленной форме, CytFeHI) по реакции:

QH2 + 2 CytFelll -> Q + 2 CytFell + 2H+

В работе трех перечисленных вмонтированных в мембрану комплексов участвуют два переносчика, перемещающиеся в пределах мембраны - ко­ фермент Q, который должен курсировать между комплексами I и III, и цито­ хром с, который должен курсировать между комплексами III и IV.

Все три процесса в нормально функционирующих комплексах сопряжены с переносом протонов через мембрану из матрикса на внутреннюю сторону внутренней митохондриальной мембраны, в результате образуется градиент концентрации протонов через мембрану, причем внутренняя сторона мем­ браны заряжается положительно относительно матрикса и, следовательно, имеет более низкое значение pH, чем матрикс.

Благодаря наличию градиента концентрации протонов система обладает некоторым запасом свободной энергии, который используется в реакции фосфорилирования ADP монофосфатом, т. е. в образовании АТР. Это осуще­ ствляется еще одним вмонтированным во внутреннюю митоходндриальную мембрану комплексом - АТФ-синтазой. Данный комплекс является многосубъединичным и при выделении распадается на два фактора - F0 и Fb

Первый из них пронизывает мембрану и формирует канал для перемеще­ ния протонов. Последний связан с мембраной через взаимодействие с F0 и по субъединичному составу может быть записан как а3рзу8е. На Р-субъединицах расположены сайты связывания АТР. Имеющиеся в настоящее время данные позволяют представить следующий механизм образования АТР, который ос­ новывается на существовании трех конформаций. Одна из них, L- (loose, не­ плотная), способна связывать ADP и фосфат. За этим связыванием следует переход конформации L в конформацию Т (tight, стиснутая). В такой кон­ формации в активном центре происходит фосфорилирование ADP. Повидимому, сильное взаимодействие с белком делает этот процесс, в растворе характеризуемый значительным повышением свободной энергии, термодина-

Цитозоль

Внешняя мембрана

Межмембранное пространство

АТФ-синтазный комплекс

Рис. 101. Схема функционирования АТФ-синтазного комплекса

мически возможным, но при этом АТР остается связанным с активным цен­ тром белка. Затем происходит переход белка в О-конформацию (open, откры­ тая), при которой резко ослабляется связь с АТР и становится возможным диссоциация АТР и последующее присоединение новой пары ADP и фосфат. Скорее всего, именно конформационный переход, приводящий к освобожде­ нию АТР, вызывается переходом протона по градиенту, образовавшемуся в цепи переноса электронов.

Глава 16. Химия ферментов

§ 16.1. Ферментативный катализ

Ни одно химическое превращение в живых организмах не происходит без участия специальных катализаторов - ферментов (энзимов). В подавляющем большинстве случаев ферменты являются либо белками, либо комплексами белков со специальными кофакторами - ионами металлов или специальны­ ми сложными органическими молекулами (простетическими группами). В этом случае белковую часть фермента называют апоферментом. Апоферменты сами по себе каталитически неактивны и становятся активными лишь

вкомплексе с кофактором. Для осуществления реакции, катализируемой ферментом, необходимым условием является образование комплекса фер­ мента с субстратом (или с субстратами, если их несколько). Этот комплекс образуется в результате многоточечного взаимодействия некоторых групп

всоставе субстратов с определенными аминокислотными остатками белка, т. е. в результате узнавания субстратов белком. Некоторые из этих остатков могут принимать участие в осуществлении самого каталитического процесса. Естественно, что далеко не все аминокислотные остатки, формирующие фермент или апофермент, принимают непосредственное участие в узнавании субстратов и каталитическом превращении. Совокупность остатков, непо­ средственно участвующих в этих процессах, называется активным центром фермента. В формировании активного центра ферментов, функционирующих как комплекс апофермента с кофактором, принимает участие сам кофактор.

Значительная группа реакций, катализируемых ферментами, использует

вкачестве субстратов специальные соединения, общие для значительного числа сходных по механизму реакций. Важнейшие из них: 1) АТР - универ­ сальный донор фосфата в реакциях фосфорилирования; 2) S- аденозилметионин - донор метальных групп в подавляющем большинстве реакций метилирования; 3) кофермент А, донор ацильных групп во всех ре­ акциях ацилирования; 4) никотинамидные и флавиновые коферменты в ог­ ромном числе окислительно-восстановительных процессов (§ 16.3). Такие субстраты обычно квалифицируют как коферменты. Обращает на себя вни­ мание тот факт, что у всех перечисленных коферментов имеется остаток аденозина, который непосредственного участия в каталитическом акте не при­ нимает. По-видимому, этот остаток необходим для опознавания коферментов активными центрами соответствующих ферментов.

Установление структуры активного центра фермента является главной задачей биоорганической химии ферментов. В ее решении наибольшую роль

На рис. 102 приведены номера аминокислотных остатков, участвующих

вобразовании промежуточного продукта с боковыми радикалами остатков гистидина, глутамина, тирозина, аспартата, цистеина, треонина, N-Н и С=0 группами главной цепи (main chain, МС). Разнообразие взаимодействий даже для одного фермента свидетельствует о том, что описать все типы возмож­ ных взаимодействий, обеспечивающих специфичность, не представляется реальным.

Широкое применение в установлении значения отдельных остатков ами­ нокислот в функционировании ферментов нашел сайт-направленный мута­ генез. Метод состоит в направленной замене в исследуемом ферменте амино­ кислотного остатка (сайта, site - место), предположительно участвующего

вузнавании или каталитическом превращении субстрата, на другой остаток, неспособный к участию в этих процессах. Такую замену можно осуществить,

если имеется в распоряжении ген, кодирующий исследуемый фермент, и встроенный в способную к размножению и экспрессии структуру, напри­ мер, плазмиду. Ген можно встроить в кольцевую ДНК вируса или плазмиды, как это описано в § 5.6, которую можно размножить и экспессировать в клет­ ке хозяина. В качестве необходимого для репликации синтетического прай­ мера используется олигонуклеотид, содержащий последовательности нук­ леотидов, фланкирующие в гене кодон заменяемой аминокислоты, и сам ко­ дон, измененный в соответствии с планируемой заменой. Экспрессия приво­ дит к мутантному ферменту. Сохранение, изменение или исчезновение ката­ литической активности у измененного фермента свидетельствует о степени участия замененного аминокислотного остатка в каталитической активности фермента. Например, для выяснения функции определенного остатка гисти­ дина, который часто входит в состав активных центров фермента, в прайме­ ре, содержащем кодирующий этот остаток гистидина кодон CAU или САС; последний может быть заменен на один из кодонов ССХ, кодирующих Leu. Остаток лейцина не может функционально заменить остаток гистидина, имидазольное кольцо которого обычно участвует в каталитическом процессе.

Метод сайт-направленного мутагенеза находит широкое применение также для установления роли отдельных аминокислотных остатков в выпол­ нении других многочисленных функций белков. В частности, введение реак­ ционноспособных аминокислотных остатков в определенные точки белка, на­ пример цистеина, позволяет вводить в эти точки различные репортерные группы.

Фермент может содержать несколько активных центров, на которых про­ исходит несколько последовательных каталитических превращений субстра­ та. Среди таких ферментов особенно примечательными являются ферменты с качающейся ножкой, позволяющей связанному субстрату доставать после­ довательно разные активные центры.

Одним из примеров такого фермента может служить синтаза жирных ки­ слот, комплекс белков (у эубактерий) или один полифункциональный белок (у эукариот, в том числе у человека), содержащий несколько активных цен­

тров, катализирующих последовательное наращивание двууглеродными фрагментами углеродного скелета жирной кислоты. Растущая цепь углерод­ ного остатка на протяжении всего процесса связана тиоэфирной связью с SHгруппой остатка фосфопантотенеина

-0P02-0-CH2-C(CH3)2-CH0H-C0-NH-(CH2)2-C0-NH-(CH2)2-SH,

который ковалентно присоединен фосфоэфирной связью к остатку серина ацил-переносящего белка (АСР - acyl-carrier potein). Ножка содержит боль­ шое число ст-связей и поэтому обладает высокой гибкостью. Это позволяет ацильному остатку попеременно перемещаться между активными центрами, катализирующими последовательные стадии биосинтеза жирных кислот из ацетильных остатков. Первичным источником ацетильных групп являются ацетилированный кофермент A, C0AS-COCH3 - основной продукт катабо­ лизма сахаров, жиров и ряда аминокислот. Ацетильный остаток карбоксилируется и образовавшийся малонильный остаток переносится от кофермента А на АСР по реакции

CoAS-COCH2COO- + АСР -> ACPS-COCH2 COO + CoASH.

Далее начинается рост углеводородной цепочки, который осуществляется четырьмя каталитическими процессами, приводящими к последовательному удлинению цепочки двууглеродными фрагментами, непосредственным доно­ ром которых является связанный с АСР малонильный остаток.

1)ACP-SCOCH2COO + ACP-SCOCH2R

ACP-SCOCH2COCH2R + ACPSH + С 02

где R- растущий в ходе синтеза жирной кислоты углеводородный радикал.

2) ACP-SCOCH2COCH2R+ NADPH ->

-» ACP-SCOCH2CHOHCH2R + NADP+

3) a c p -s c o c h 2c h o h c h 2r -+ a c p -sco ch = ch ch 2r 4) ACP-SCOCH=CHCH2R + NADPH ->

-» ACPCOCH2CH2CH2R + NADP+

Каждая из этих реакций естественно проходит с участием своего актив­ ного центра, расположенного либо на разных полипептидных цепях (у эубактерий), либо на одном полифункциональном белке (эукариоты, в том числе у человека).

где Км - константа Михаэлиса, равная (к.\ + k2)/k\, а [Е] - концентрация фер­ мента. Эта зависимость является гиперболической, и при достаточно высокой концентрации субстрата скорость достигает предельного значения Fmax = &г[Е], которое называют максимальной скоростью. Поэтому уравнение для зависимости скорости реакции от концентрации субстрата может быть запи­ сано в виде

у_ Vшах

Это соотношение называют уравнением Михаэлиса - Ментен. Для двух­ субстратных реакций и процессов, у которых вторая стадия является обрати­ мой, уравнение имеет более сложный вид. С такими уравнениями можно по­ знакомиться в специальных курсах, посвященных кинетике ферментативных реакций.

Если константа скорости диссоциации комплекса фермент-субстрат су­ щественно выше, чем внутрикомплексного превращения (£.i»£2), то кон­ станта Михаэлиса становится приблизительно равной отношению k.\/k\>т. е. равной константе диссоциации комплекса фермент-субстрат. В этом случае константу Михаэлиса можно рассматривать как величину, характеризующую сродство субстрата к ферменту.

Параметры, определяющие скорость ферментативной реакции, зависят от таких факторов окружающей среды, как температура, ионная сила раствора и pH среды.

На скорость ферментативной реакции может влиять присутствие некото­ рых специальных веществ, которые могут или тормозить (ингибировать), или ускорять (активировать) фермент. Среди подобных веществ мы ограничимся рассмотрением важнейших, к числу которых следует отнести конкурентные ингибиторы и аллостерические ингибиторы или активаторы фермента.

Конкурентные ингибиторы обладают сходством по своей структуре с ка- ким-либо субстратом фермента и поэтому конкурируют с субстратом за свя­ зывание с активным центром. В то же время у них отсутствует какая-либо связь, которая должна подвергаться химическому превращению, катализи­ руемому этим ферментом. Следовательно, молекулы такого ингибитора свя­ зываются с активным центром фермента, но за этим не следует какого-либо превращения. Типичным, широко используемым в различных исследованиях конкурентным по отношению к АТР ингибитором является аналог АТР,

в котором атом О, участвующий в образовании макроэргической связи между атомами а-Р и Р-Р, заменен на СН2-группу. В этом соединении присутствуют все основные структурные элементы АТР, которые могут участвовать в спе­ цифических взаимодействиях с активными центрами многочисленных фер­ ментов, катализирующих реакции с участием АТР. Однако по связи Р-СН2-Р не может проходить гидролиз, который обеспечивает благоприятную термо­ динамику сопряженного процесса. Поэтому приведенный аналог называют негидролизумым аналогом АТР.

Аллостерические ингибиторы, или активаторы, - это соединения, кото­ рые, связываясь со специальным центром фермента, находящимся вне его активного центра, существенно влияют на его активность, либо подавляя (ал­ лостерические ингибиторы), либо существенно ее усиливая (аллостериче­ ские активаторы). В этом случае какого-либо структурного сходства между субстратом и ингибитором не требуется, что и подчеркивается словом «аллостерический».

Чтобы ориентироваться во множестве происходящих у живых организмов биохимических превращений, необходима определенная систематика. Тако­ вая была создана Международным союзом по биохимии (International Union of Biochemistry, IUB). Изложение ее основных принципов дается в курсах по биологической химии и не является предметом биоорганической химии. Для дальнейшего изложения нашего курса достаточно сказать, что все ферменты разделены на шесть классов:

1) оксидо-редуктазы, катализирующие различные окислительно­ восстановительные реакции;

2) трансферазы, катализирующие перенос отдельных групп от одной мо­ лекулы к другой;

3) гидролазы, катализирующие многочисленные реакции гидролиза; 4) лиазы, катализирующие негидролитическое расщепление молекул, со­

провождающееся образованием новой двойной связи; 5) изомеразы, катализирующие различные процессы изомеризации;

6) синтетазы или лигазы, катализирующие реакции синтеза, сопровож­ даемые расщеплением одной из макроэргических связей у АТР или GTP.

Каждый класс разделен по типу катализируемых реакций на подклассы, а последние - на подподклассы. В связи с этой классификацией каждому ви­ ду катализируемых реакций присвоен цифровой шифр, состоящий из четы­ рех разделенных точками цифр, показывающих номер класса, номер под­ класса, номер подподкласса и порядковый номер фермента в данном подподклассе.

Поскольку систематическое описание ферментов или групп ферментов является предметом биохимии, а не биоорганической химии, эта классифи­ кация будет использоваться лишь эпизодически по мере рассмотрения от­ дельных представителей необъятного числа ферментов с позиции задач, ре­ шаемых биоорганической химией.

§ 16.2. Белки как кислотно-основные и нуклеофильные катализаторы

Большое число ферментов катализируют реакции, которые сводятся к пе­ ремещению нескольких протонов в пределах одной молекулы субстрата или их перераспределению между несколькими молекулами. Такие процессы должны происходить с помощью кислотно-основного катализа, осуществ­ ляющегося с участием кислых или основных остатков самого белка. При этом в одном направлении такой остаток функционирует как кислота, а в противоположном - как сопряженное основание. Обозначая рядом с трех­ буквенным символом аминокислоты только участвующую в переносе прото­ на группу, можно записать следующие основные сопряженные пары кислота-

основание: Asp-COOH/Asp-COO', Glu-COOH/Glu-COO', Tyr-OH/Tyr-O’, Cys- SH/Cys-S', Lys-NH3+/Lys-NH2, His-ImH+/His-Im, где Im - имидазол. В качестве примера такого фермента можно привести панкреатическую рибонуклеазу, которая катализирует гидролиз фосфодиэфирных связей в РНК. Промежу­ точным соединением в этом процессе является внутримолекулярная переэтерификация, результатом которой является замена связи фосфорильного ос­ татка с 5’-ОН-группой нуклеозида на связь с 2’-ОН-группой предшествую­ щего нуклеозида, что приводит к разрыву полинуклеотидной цепи и образованию циклофосфата. За этим следует гидролиз циклофосфата с об­ разованием 3’-концевого фосфата (рис. 103).

Как видно из рис. 103, на первой стадии должно произойти удаление про­ тона от 2’-ОН-группы и присоединение протона к 5’-ОН-группе. В первом процессе акцептором протона является непротонированное имидазольное кольцо остатка гистидина, а во втором донором протона служит протонированное кольцо имидазола другого остатка гистидина. На второй стадии ос­ татки гистидина меняются ролями.

Как показывает установленное методом рентгеноструктурного анализа строение активного центра панкреатической рибонуклеазы, наряду с двумя непосредственно участвующими в каталитическом процессе остатками гис­ тидина в активном центре находятся некоторые другие остатки, обеспечи­ вающие необходимую ориентацию субстрата в активном центре (рис. 104).