КНОРРЕ_3227

При попытках использовать образование триплексов для воздействия на ДНК при переходе к эукариотическим клеткам оказалось, что хромосомная ДНК экранирована от действия реагентов множеством белков. Эта проблема еще ждет своего решения.

Создание олигонуклеотидов, образующих дуплексы или триплексы, в том числе их производных, несущих реакционноспособные группы, сразу же сталкивается с новой серией проблем, когда от экспериментов с изолирован­ ными нуклеиновыми кислотами переходят к клеткам и тем более к целым организмам. Уже говорилось о сложности прохождения таких реагентов че­ рез клеточные мембраны. Серьезным осложнением является деградация оли­ гонуклеотидов или олигонуклеотидных адресов под воздействием внутри­ клеточных, а в случае многоклеточных организмов - и внеклеточных нуклеаз (например, в плазме крови), которые повреждают адресующую часть реаген­ та. Для преодоления этой трудности предложен ряд подходов, среди которых наиболее широко используемым в настоящее время является применение фосфоротиоатных аналогов олигонуклеотидов со структурой межнуклеозидного узла,

-О -Р -О -

I

О"

устойчивость которого к гидролизу межнуклеотидной связи существенно выше, чем в случае классических фосфодиэфиров. Такие мономеры получа­ ются из тех же фосфамидитов, которые используются при химическом синте­ зе олигонуклеотидов (см. § 5.3), но вместо окисления они обрабатываются каким-либо донором атома серы. В качестве таких доноров предложено не­ сколько реагентов, среди которых наиболее широко используемым является 1,2-бензодитиол-1,1-диоксид.

В настоящее время более перспективными представляются описанные в § 5.7 аналоги олигонуклеотидов, построенные из замкнутых нуклеотидов, из морфолиновых нуклеотидов и PNA-нуклеотидов.

Однако даже для воздействия на заведомо однонитевые информационные РНК исследователи столкнулись с тем, что часто мРНК имеет достаточно

Эффект оценивался по чувствительности клеток КВ-8-5 к противоопухоле­ вому препарату винбластину. Уже при концентрации винбластина 5 нМ чис­ ло выживших клеток составляло менее 50 % от контроля, а при концентра­ ции 300 нМ было ниже 10 %.

§ 12.4. Установление областей контакта нуклеиновой кислоты. Футпринтинг

Среди многочисленных высокоселективных межмолекулярных взаимо­ действий, реализуемых в живой природе, важнейшим является взаимодейст­ вие белков с нуклеотидами и нуклеиновыми кислотами. Большое число фер­ ментов представляет собой комплексы или ковалентные аддукты апоферментов с нуклеотидными кофакторами. Нуклеотидные фрагменты являются компонентами таких важнейших коферментов, как никотинамидные коферменты, NAD и NADP и кофермент А. Субстратом всех фосфотрансфераз и лигаз являются АТР и GTP. Естественно, все перечисленные низкомолеку­ лярные соединения должны специфично взаимодействовать с апоферментами или ферментами.

Взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами играют определяю­ щую роль практически во всех процессах, обеспечивающих умножение, ре­ парацию и экспрессию генетической информации, а в большом числе случа­ ев и регуляцию этих процессов. При репликации ДНК должна взаимодейст­ вовать с ДНК-полимеразой и рядом вспомогательных белков, при репарации

-с белками, обеспечивающими все стадии этого процесса, при транскрипции

-с РНК-полимеразой и факторами транскрипции. Для обеспечения трансля­ ции должно произойти взаимодействие тРНК с соответствующими аминоа- цил-тРНК-синтетазами, а после присоединения аминокислот - взаимодейст­ вие аминоацил-тРНК с определенными сайтами рибосом, скорее всего, с оп­ ределенными рибосомными белками. В составе самой рибосомы многие бел­ ки связаны с рибосомными РНК.

Естественно, что протяженные молекулы нуклеиновых кислот при обра­ зовании тех или иных специфических комплексов связываются с белками только некоторой частью нуклеотидов. Поэтому при изучении белково­ нуклеиновых взаимодействий первый вопрос, встающий перед исследовате­ лями, - это выявление области контакта белков с нуклеиновой кислотой. Вы­ явление области контакта нуклеиновой кислоты с некоторым белком может быть проведено путем химической модификации нуклеиновой кислоты. При этом нуклеотиды, находившиеся в области контакта с белком, остаются либо вообще немодифицированными, либо с резко пониженным по сравнению с остальными остатками уровнем модификации. Белок, закрывший фрагмент нуклеиновой кислоты, оставляет след или отпечаток своего присутствия. Этот подход получил название футпринтинг (отпечаток ноги).

Наиболее удобным для этой цели является использование химической модификации, приводящей к разрыву межнуклеотидных связей. В качестве примера можно привести работы, в которых использовался описанный в § 2.5 метод расщепления рибонуклеиновых кислот по фосфатам обработкой ал­ килнитрозомочевиной.

Следует обратить внимание на важную особенность химической модифи­ кации, которую нужно в максимально возможной степени принимать во вни­ мание. Если модификация проводится так, что в основном затрагивается одна точка биополимера, то реагент заведомо имеет дело с биополимером с непо­ врежденной структурой и функцией. Вторая модификация проходит с уже модифицированным, т. е. поврежденным биополимером, что может приво­ дить к искаженной информации. Однако определение единственной точки модификации при проведении множественной модификации требует очень чувствительного метода регистрации. В случае нуклеиновых кислот это дос­ тигается введением на один из концов нуклеиновой кислоты высокорадиоак­ тивной метки. Чаще всего это делается с помощью полинуклеотидкиназы - фермента, катализирующего присоединение по 5’-концу [32Р]-фосфата с ис­ пользованием [/-32Р]АТР. Далее набор образовавшихся в результате щелоч­ ного расщепления фрагментов РНК разделяется с помощью гельэлектрофореза, и по интенсивности соответствующих полос на радиоавто­ графе определяется степень модификации в каждой точке. В комплексе с ферментом часть полос, соответствующая точкам, защищенным от алкилирования, оказывается малоинтенсивной, что позволяет определить область контакта.

В последнее время для футпринтинга начали широко использовать ОНрадикапы, которые атакуют углеводные фрагменты как в одно-, так и в дву­ нитевых участках ДНК. Происходящие при этом превращения, как правило, многостадийны и зависят от присутствия 0 2. В главе 2 (см. § 2.3, рис. 16) приведена схема превращений остатка дезоксирибозы при отрыве атома Н в положении 4’ в присутствии кислорода. Видно, что процесс заканчивается разрывом полинуклеотидной цепи. При наличии радиоактивной метки на од­ ном из концов полинуклеотидного фрагмента с помощью гель-электрофореза легко определяется точка разрыва.

Радикалы ОНпроще всего могут быть генерированы с помощью реакти­ ва Фентона - смеси соли Fe2+ и Н2О2 по реакции

Fe2+ + Н20 2 - * Fe2+OH + ОН-

Ионы железа берутся в виде комплекса с этилендиаминтетрауксусной ки­ слотой (ЭДТА). Рекомендованы и более сложные соединения, например, коньюгат бромистого метидия и ЭДТА. В этом случае за счет интеркаляции метидия реагент оказывается достаточно прочно связан с ДНК, и образование свободных радикалов происходит вблизи ДНК, чем достигается большая эф-

феюгивность процесса. В силу небольшого размера радикалов локализация области контакта является достаточно точной.

Наряду с химическими методами для футпринтинга широко используют ферменты, гидролизующие нуклеиновые кислоты. Но из-за большого разме­ ра «инструмента» ясно, что точность локализации области взаимодействия будет существенно ниже.

§ 12.5. Основные структурные элементы белков, ответственные за взаимодействия с нуклеотидами и нуклеиновыми кислотами.

Цинковые пальцы

Систематический анализ комплексов белков с нуклеотидами и нуклеино­ выми кислотами с установленной пространственной структурой этих ком­ плексов или их фрагментов уже позволил выявить некоторые закономерно­ сти таких взаимодействий на уровне определенных мотивов, присутствую­ щих в третичной структуре.

Простейшим мотивом белковой структуры, способным узнавать двунитевую ДНК, является мотив, состоящий из двух а-спиралей, связанных корот­ ким однонитевым участком, обеспечивающим поворот одной спирали отно­ сительно другой. Этот мотив так и называют «спираль-поворот-спираль» (НТН, helix-tum-helix). В настоящее время он найден в структуре многих со­ тен белков прокариот и эукариот. С-концевой фрагмент полипептидной цепи, формирующий эту структуру, называют узнающей спиралью, поскольку он связан с соответствующим участком ДНК системой нековалентных взаимо­ действий и в соответствии со структурой этого участка различен для разных белков.

Некоторые белки, взаимодействующие с В-ДНК, могут образовывать структуру, представляющую собой мотив из двух «-спиральных фрагментов вместе с третьей узнающей спиралью, которая связывается с большой бо­ роздкой ДНК. Эта структура получила название гомеодомена. Такие мотивы

§ 12.5. Элементы белков, ответственные за взаимодействия с нуклеотидами 275

внастоящее время выявлены в большом количестве при анализе установлен­ ных пространственных структур. Так, только среди белков дрозофилы най­ дено более 60 гомеодоменов.

Уэукариот большое значение в белково-нуклеиновых взаимодействиях играют элементы пространственной структуры, получившие название цинко­ вых пальцев. Общей чертой всех цинковых пальцев является наличие у них

вопределенных положениях четырех остатков цистеина или гистидина, ко­ торые координируют ионы цинка. Классической считается конструкция, в ко­ торой в качестве лигандов выступают два остатка цистеина и два остатка гистидина. В качестве примера на рис. 83 приведена структура цинкового пальца одного из белков лягушки. Один из белков с такой структурой при­ нимает участие в активации транскрипции генов эукариотической рибосомной РНК.

Рис. 83. Структура цинкового пальца одного из белков лягушки

Наряду с цинковыми пальцами, имеющими в качестве лигандов цинка два остатка цистеина и два остатка гистидина, обнаружены цинковые паль­ цы, имеющие в качестве лигандов четыре остатка цистеина или три остатка цистеина и один остаток гистидина. Первые встречаются у рецепторов тиреоидных гормонов, рецептора ретиноевой кислоты, рецептора витамина D3 и рецепторов ряда стероидных гормонов. Второй тип цинковых пальцев най­ ден у некоторых белков ретровирусов.

Еще один мотив, существенный для белково-нуклеиновых взаимодейст­ вий, - лещиновые застежки. Они образованы двумя а-спиралями, на одной из внешних сторон которых преобладают гидрофобные аминокислоты, в первую очередь, остатки лейцина.

§ 12.6. Молекулярная селекция нуклеиновых кислот. Аптамеры

Благодаря способности ДНК к репликации и транскрипции открылась возможность создавать нуклеиновые кислоты с разными свойствами, в част­ ности нуклеиновые кислоты, обладающие специфическим сродством к оп­ ределенным низкомолекулярным соединениям или макромолекулам, к кото­ рым природные РНК или ДНК сродством не обладают. Это делается с по­ мощью метода молекулярной селекции (SELEX, Systematic Evolution of Ligands by EXponentional enrichment).

Молекулярная селекция, которой посвящен настоящий раздел, по своему принципу похожа на обычную биологическую селекцию, в ходе которой из множества особей отбирают те, которые обладают желательными биологиче­ скими характеристиками, а затем проводят их размножение. При молекуляр­ ной селекции осуществляют отбор нуклеиновых кислот, обладающих жела­ тельными свойствами, а затем их размножают с помощью ПЦР (см. § 5.5). Проще всего объяснить принцип метода на примере создания нуклеиновых кислот, обладающих сродством к определенному низкомолекулярному ли­ ганду или полимеру. В качестве материала для первичной селекции создают сложную смесь молекул нуклеиновой кислоты, среди которой могут оказать­ ся и молекулы с нужным сродством. Это проводится путем введения в струк­ туру молекул ДНК так называемой рандомизованной последовательности,

т. е. фрагмента, структура которого у различных молекул неодинакова. Это достигается тем, что на некоторых шагах синтеза ДНК с помощью ДНКсинтезатора полимеразы в реакционную смесь вводят не один определенный синтон, а смесь всех четырех. На каждом этапе элонгации в разные растущие цепи будет случайно включаться один из четырех нуклеотидов. На рандомизованном участке длиной п нуклеотидов у разных молекул может оказаться любая из 4Ппоследовательностей. Среди образующегося множества молекул могут оказаться обладающие необходимым свойством. Провести первичный отбор нужных ДНК не представляет труда. Для этого смесь нуклеиновых ки­ слот, содержащих рандомизованный фрагмент, пропускают через колонку, содержащую нерастворимый носитель, на который иммобилизован соответ­ ствующий лиганд. На колонке задержатся лишь молекулы, обладающие сродством к иммобилизованному лиганду. Основная масса исходного мате­ риала проходит через колонку, не задерживаясь. Изменением условий можно затем добиться, чтобы отдельно элюировались те нуклеиновые кислоты, ко­ торые обладают сродством к иммобилизованному лиганду. Эти нуклеиновые

Глава 13. Биоорганическая химия углеводов

§ 13.1. Моносахариды. Номенклатура. Способы изображения

Моносахариды - это соединения, молекулы которых представляют собой неразветвленную цепочку из частично окисленных атомов углерода. При од­ ном из этих атомов находится карбонильная, а при других - по одной гидроксигруппе. В соответствии с этим все моносахариды имеют брутго-формулу СпН2пО„, т. е. состоят из п атомов углерода и п молекул воды, откуда и происходит название углеводы. Такое же название применяется и ко всем олиго- и полимерам, образованным из моносахаридов. Этой брутто-формуле соответствуют и такие низкомолекулярные соединения, как формальдегид СНгО и гликолевый альдегид СНгОНСНО. Однако обычно моносахаридами называют соединения с числом атомов С не ниже трех. В зависимости от числа углеродных атомов их называют триозами (и = 3), тетрозами (и = 4), пентозами (п = 5), гексозами (и = 6) и т. д. Моносахариды, молекулы которых содержат альдегидную группу, называют альдозами, а если они содержат кетогруппы - кетозами. При нумерации атомов углерода кетогруппе присваи­ вается минимальный номер, т. е. у альдоз первый номер присваивается атому альдегидной группы, а у кетоз - крайнему атому, ближайшему к кетогруппе. Моносахариды, содержащие более девяти углеродных атомов, в природе не найдены.

Для исследования моносахаридов применяются в основном методы орга­ нической химии, и поэтому они традиционно изучаются в курсах органиче­ ской химии. В природе моносахариды редко встречаются в свободном виде. В живых организмах они присутствуют в виде своих производных, чаще все­ го эфиров фосфорной кислоты, либо в составе полимерных сахаров. В сво­ бодном виде в значительных количествах в природе встречаются глюкоза, как в растениях, так и в животных, и фруктоза в плодах растений и меде.

Олигосахариды состоят из нескольких моносахаридных звеньев, связан­ ных атомами кислорода. Низшие олигосахариды содержат 2-5 звеньев, выс­ шие - 6-10. Они имеют сравнительно небольшую молекулярную массу и могут изучаться обычными методами органической химии.

Полисахариды - это полимеры моносахаридов, связанных через атом ки­ слорода. Установление строения полисахаридов представляет собой слож­ ную задачу, поскольку мономерные звенья моносахаридов полифункциональны и могут связываться между собой большим набором способов. Для исследования полисахаридов используют методы как традиционной органи­ ческой химии, так и методы, характерные для химии полимеров. Полисаха-