КНОРРЕ_3227

370 Глава 16. Химия ферментов

(I) + (II) -> Gp YiPY2 ..... pYm.lPYm + (р) X-i...рХцpXiPXi+1 pXi+2...

Согласно этой схеме в процессе в качестве субстрата участвует гуанозин. На первой стадии сплайсинга происходит переэтерификация: вместо фосфоэфирной связи первого нуклеотида интрона с предшествующим нуклеотидом экзона образуется связь интрона с остатком гуанозина. Однако отщепивший­ ся экзон, даже не будучи связан ковалентно с остальной частью предшест­ венника, остается вблизи этой части и участвует во второй стадии, также представляющей собой реакцию переэтерификации. При этом вместо связи между последним нуклеотидом интрона и следующим за ним нуклеотидом экзона происходит воссоединение последнего с концом фрагмента, отще­ пившимся на первой стадии. В итоге интрон выщепляется в виде производ­ ного, содержащего дополнительный остаток гуанозина на 5'-конце. Интроны, вырезаемые из пре-мРНК по такому механизму, получили название интронов группы I. Они были обнаружены у ряда организмов в ядрах, митохондриях и хлоропластах.

Дальнейшие исследования показали, что вырезанные интроны обладают каталитическим действием. Одним из первых детально изученным является интрон, вырезанный из пре-рРНК Tetrahymena thermophila, который в резуль­ тате нескольких последовательных превращений укорачивается на 19 нук­ леотидов с 5’-конца и превращается в рибозим, способный осуществлять большое число каталитических актов. Этот рибозим обычно называют L-19 IVS (intervening sequence, лишенная 19 нуклеотидов). Он ускоряет гидролиз поли(С) в Ю10 раз по сравнению с самопроизвольным.

Второй тип вырезания интронов был впервые обнаружен при изучении сплайсинга митохондриальных пре-мРНК. В этом случае сплайсинг начина­ ется со внутримолекулярной переэтерификации, при которой связь 5’- фосфата первого нуклеотидного остатка интрона с З’-ОН-группой последне­ го остатка экзона заменяется на связь с 2’-ОН-группой одного (определенно­ го) из внутренних остатков аденозина интрона. Возникает структура, в кото­ рой этот внутренний аденозин связан тремя фосфодиэфирными связями с участием всех его ОН-групп с соседями слева и справа и с 3’-концевым фосфатом интрона. Эту структуру можно представить в виде

После этого происходит соединение экзонов и выщепление интрона в ви­ де структуры типа лассо (lariat)

Такие интроны получили название интронов группы II. Они характерны для митохондрий грибов и растений и составляют большую часть интронов хлоропластов.

Описанные типы рибозимов осуществляют вырезание интронов. Однако описан и детально изучен другой тип рибозимов, которые катализируют расщепление полирибонуклеотидных цепей. Такие рибозимы обнаружены в составе молекул вироидов и вирусоидов. Молекулы этих инфекционных РНК обычно образуются в виде длинных цепей, представляющих собой тан­ дем из нескольких инфекционных молекул РНК. В этих случаях функция рибозима состоит в расщеплении этих цепей на функционально активные моле­ кулы РНК. При этом образуются 2’,3’-циклофосфат и свободная 5’-ОН-группа. В состав вироидов и вирусоидов входит два основных типа рибозимов.

Один тип представлен шпилечнымирибозимами (рис. 109).

Шпилечные рибозимы встречаются как компоненты «минус» РНК ин­ фекционных агентов. Они состоят из четырех двунитевых фрагментов. Меж­ ду спиральными участками попарно находятся однонитевые участки, соеди­ ненные петлями, в основном консервативные. Точка, по которой происходит расщепление, находится в первой петле. Между вторым и третьим двунитевыми фрагментами имеется сгиб, в результате которого первый и последний фрагменты пространственно сближены.

Рис. 109. Шпилечный рибозим, входящий в состав минус-цепи сателлита вируса кольцевой пятнистости табака. Стрелкой указана расщепляемая межнуклеотидная связь. Нумерация ведется от 3’-конца

Наиболее изучены рибозимы, функционально активная часть которых представлена в виде вторичной структуры, имеющей сходство с головкой молотка (hammerhead). В отличие от шпилечных рибозимов, они являются компонентами «плюс» РНК частиц вироидов и вирусоидов (сателлитов виру­ сов). На рис. 110 представлена структура рибозима, входящего в состав са­ теллита вируса преходящей полосатости люцерны.

Как видно из рис. 110, рибозим hammerhead содержит три дуплекса, при­ чем между дуплексами II и Ш находится однонитевая последовательность, формирующая функционально активную структуру. На стыке дуплексов I и III находится остаток С, после которого проходит каталитическое расщепле­ ние. У данного рибозима расщепление происходит по фрагменту UCU, у не­ которых других hammerhead рибозимов - по фрагменту UCA. Такие рибози­ мы широко исследуются, поскольку могут быть достаточно легко синтезиро­ ваны и позволяют получать различные модифицированные формы, напри­ мер, заменять некоторые рибонуклеотидные остатки на дезоксирибонуклеотидные. В связи с этим для удобства описания различных замен предложена специальная система нумерации нуклеотидных остатков.

Согласно этой системе каждому нуклеотидному остатку присваивается два номера. Первый из них присваивается всем остаткам, которые входят в однонитевые (но не петлевые) участки или являются основанием дуплек­

сов. Номер 1 присваивается нуклеотиду, следующему за расщепляемым ос­ татком С. Далее отсчет ведется по часовой стрелке. Второй номер присваива­ ется нуклеотидам дуплекса в порядке удаления от основания так, что вторые номера у комплементарных нуклеотидов совпадают. В петлях вводится своя нумерация, причем первый номер обозначается как L1 и L2 для первой и вто­ рой петель (loop - петля). Для иллюстрации этих правил на рис. 110 остатки нуклеотидов снабжены номерами.

преходящей полосатости люцерны

Важная особенность шпилечных и hammerhead рибозимов состоит в том, что двойные спирали в них замкнуты петлями, не играющими роли в функ­ ционировании рибозима. Поэтому по этим петлям можно провести расщеп­ ление, разрезав, таким образом, исходный рибозим на две части, которые можно разделить хроматографически или электрофорезом. В сумме эти части составляют функционально активный фермент, у которого расщепление про­ ходит по той же фосфоэфирной связи, что и в случае нативного рибозима. Ту половину, в которой находится эта связь, можно рассматривать как субстрат, а вторую - как рибозим. Если отделить молекулу субстрата от рибозима, то последний можно использовать для расщепления новой молекулы субстрата, т. е. процесс становится истинно каталитическим. В качестве примера на рис. 111 представлена структура того же hammerhead рибозима, что и на рис. 110, но расщепленного по петле 1.

Аналогично может быть получен каталитически активный рибозим из шпилечного фермента.

C * G

G *C

G *C

G *C

A G

U G

Рис. 111. Структура сателлита рибозима вируса преходящей полосатости люцер­ ны с расщепленной петлей между дуплексами III и II

Кроме перечисленных типов, описано еще несколько представителей рибозимов. В начале раздела уже было сказано о полирибонуклеотиде, входя­ щем в состав рибонуклеазы Р, катализирующей гидролитическое отщепление от 5’-конца предшественников тРНК нескольких избыточных нуклеотидов, что необходимо для их превращения в функционально активную тРНК.

Свойствами рибозима, кроме того, обладает РНК вируса гепатита 8. По­ лучены также данные, что при биосинтезе белков на рибосомах последние функционируют как рибозим.

Открытие рибозимов стимулировало целый ряд исследований с целью выяснения возможности катализировать реакции другого типа с помощью РНК-катализаторов. Так как структурные мотивы, обладающие каталитиче­ скими свойствами, оказались довольно разнообразными, для их выявления был широко использован метод селекции in vitro, рассмотренный в § 12.6.

Открытие рибозимов вызвало серьезный интерес у ученых, занятых во­ просами происхождения жизни. До открытия рибозимов, когда преобладала точка зрения, что катализаторами могут быть только белки, возникал вопрос: что же появилось раньше - нуклеиновые кислоты, которые были необходи­ мы для передачи из поколения в поколение информации, или белки, которые могли катализировать различные необходимые для развития жизни реакции, в том числе и реакции синтеза новых молекул нуклеиновых кислот, необхо­ димые для сохранения и реализации информации. С открытием рибозимов появилась возможность предположить, что жизнь началась с нуклеиновых кислот, которые наряду с информационной функцией могли служить и ката­ лизаторами некоторого набора биохимических процессов. Белки могли поя­ виться на более поздних этапах эволюции.

тором фосфатного остатка и могла быть связана с олигонуклеотидом (3), комплементарным 5’-концу РНК (2), иммобилизованным на нерастворимом носителе. РНК (1) содержала рандомизованную последовательность (4), (в описываемой работе 230 нуклеотидов) и 3’-концевую последовательность

(5)определенной структуры, необходимую при последующей процедуре ам­ плификации для связывания одного из праймеров. Молекулу (1) получали транскрипцией соответствующей ДНК, снабженной промотором для транс­ крипции, с помощью РНК-полимеразы фага Т7. В соответствии с механиз­ мом инициации транскрипции на ее 5’-конце присутствовала трифосфатная группа. РНК (1) и (2) были сконструированы так, что образовывали шпильку, в которой 3’-концевая ОН-группа РНК (2) и трифосфатная группа РНК (1) были сближены. Это создавало благоприятные стерические условия для про­ текания реакции (а) между этими группами с образованием межнуклеотидной связи, сопровождающейся отщеплением пирофосфата. Но, кроме того, для протекания реакции с ощутимой скоростью необходимо было участие катализатора. У РНК (1) среди ее рандомизованных фрагментов оказались структуры, способные катализировать образование межнуклеотидной связи. С их участием происходило образование конъюгатов (6), 5’-конец которых составляла молекула (2), и он, тем самым, отличался от 5’-конца не вступив­ ших в реакцию РНК (1). Это дало возможность отделить от них конъюгаты

(6)путем сорбции на иммобилизованном олигонуклеотиде (3). Этим прово­ дился отбор (селекция) рандомизованных последовательностей олигорибонуклеотидов, обладающих желаемой каталитической активностью. Отобран­ ные конъюгаты десорбировались с носителя (повышением температуры или резким уменьшением ионной силы раствора, стадия (Ь)). Десорбированная РНК (6) подвергалась обратной транскрипции, и полученная кДНК (6’) амплифицировалась с использованием ДНК-праймеров, комплементарных 5’- концу РНК (2) и 3’-концу РНК (1) (стадия (с)). кДНК и соответственно полу­ ченные при амплификации ее многочисленные копии содержали в 3’-концевой части последовательность, кодирующую подвергнутую селекции РНК (1).

Для повторения цикла селекции нужно было путем транскрипции воссоз­ дать РНК (1), но уже прошедшую первую селекцию. Чтобы создать матрицу для такой транскрипции, на стадии (d) к ДНК (6’) добавлялся праймер (8), состоящий из одной из нитей промотора Т7 РНК-полимеразы и участка, ко­ дирующего 5'-конец РНК (1). Путем репликации этой конструкции на стадии (е) получалась частично двунитевая ДНК со свисающим (2’) фрагментом. Ее амплификация на стадии (f) приводила к двунитевой ДНК, содержащей про­ мотор Т7 РНК-полимеразы и последовательность, кодирующую РНК (1), прошедшую селекцию на каталитическую активность. Транскрипция этой структуры на стадии (g) приводила к большому числу молекул РНК (1), но уже предварительно отобранных в результате проведенной процедуры селек­ ции. Образовавшиеся рибозимы можно было далее использовать для повтор­ ной селекции. Таким образом был получен рибозим, осуществлявший соеди­

нение РНК (1) и (2) с константой скорости 8 ч'1, в то время как с олигонукле­ отидами, не подвергавшимися молекулярной селекции, эта величина состав­ ляла ЗхЮ^ч'1.

Как уже указывалось выше, в природе рибозимы встречаются в качестве фрагментов РНК. В последние годы было установлено, что катализаторы мо­ гут быть образованы и в виде молекул ДНК. Такие рибозимы были получены методом молекулярной селекции. Они получили название ДНК-зимов. В на­ стоящее время наиболее исследованы два вида ДНК-зимов, катализирующих расщепление РНК. Они обозначаются 8-17 и 10-23. Цифрами указаны раунд амплификации и номер отобранного после этого раунда клона. На рис. 113 приведены каталитические ДНК-мотивы и расщепляемые РНК-фрагменты.

Y = U или С

Рис. 113. ДНК-зим (нижняя цепь) комплементарно связывается с РНК-субстратом (верхняя цепь). Расщепление происходит по сайтам, указанным стрелкой

Селекция проводилась с использованием специальной олигонуклеотидной конструкции, содержащей на 55-конце остаток биотина В, иммобилизо­ ванный на носителе, содержащем стрептавидин (рис. 114).

Рис. 114. Полинуклеотидная конструкция для селекции ДНК-зима

Конструкция содержит рибоолигонуклеотид (1), связанный с биотином спейсером (2), рандомизованный ДНК-фрагмент (3) и два олигодезоксирибонуклеотида (4) и (5) для связывания праймеров при последующих раундах амплификации. Те последовательности во фрагменте (3), которые обладают РНКазной активностью, расщепляют РНК-фрагмент и переводят полученные олигонуклеотиды в раствор. Далее они могут амплифицироваться и исполь­ зоваться в следующем раунде селекции.

Глава 17. Гормоны

§ 17.1. Эндокринная регуляция физиологических процессов. Гормоны и вторичные посредники

Вздоровых многоклеточных организмах сбалансированно во времени

ив пространстве протекают все запрограммированные биохимические про­ цессы. Делятся клетки, создаются популяции функционально дифференциро­ ванных клеток, формируются высокоспециализированные ткани, транслиру­ ются образовавшиеся информационные РНК, протекают многочисленные метаболические процессы. Клетки взаимодействуют друг с другом. Живые организмы функционируют в непрерывно изменяющихся условиях и должны реагировать на эти изменения. Для согласованной работы как клеток, так

ивсего организма в целом должны существовать процессы управления всей поступающей информацией, а также сигнальные вещества, управляющие этими процессами. Все это определило появление разнообразных форм орга­ низации межклеточных взаимодействий и механизмов передачи информации или в конечном счете регуляции жизнедеятельности организма, что привело к появлению соединений, выполняющих функции сигнальных веществ, пере­

дающих самую разнообразную информацию.

В ходе эволюции в организмах животных сформировались две основные системы, отвечающие за установление строгого порядка, позволяющего со­ хранить организованность протекающих процессов и целостность живого организма. Это нервная и эндокринная системы.

Основные вопросы, касающиеся формирования и функционирования нервной системы, находятся вне компетенции биоорганической химии и яв­ ляются предметом физиологии. Некоторые сведения о нервной системе крат­ ко даны в разд. 6.2.2.

Эндокринная система состоит из эндокринных желез (желез внутренней секреции), вырабатывающих специальные вещества, которые разносятся стоком крови и лимфы по всему организму и воздействуют на процессы, протекающие в соответствующих органах. Такими специальными вещества­ ми, которые играют роль сигналов, посылаемых в определенных физиологи­ ческих состояниях организма к соответствующим органам-мишеням, но сами не принимают участия в метаболических процессах, являются гормоны (от греч. уорцао - побуждаю к действию).

Эндокринная система большинства позвоночных представлена следую­ щими железами: гипоталамус, гипофиз, надпочечники, поджелудочная желе­ за, щитовидная и околощитовидная железы, половые железы, эпифиз, тимус.