КНОРРЕ_3227

410 Глава 19. Антибиотики

низмов клеточная стенка состоит из большого числа слоев пептидогликана, составляющего порядка 30-70 % клеточной стенки. Поэтому грамположительные бактерии при промывании окрашенного препарата спиртом не теря­ ют свою окраску, а грамотрицательные - обесцвечиваются.

Наряду с этим найдена значительная группа антибиотиков, которые воз­ действуют на определенные стадии биосинтеза белков и нуклеиновых ки­ слот. Поскольку эти процессы существенны при размножении вирусов и при интенсивном делении клеток, то такие антибиотики могут блокировать раз­ витие вирусной инфекции и неограниченное размножение клеток, в том чис­ ле, при росте опухолей (§§ 19.4, 19.5).

Одна из основных проблем при применении антибиотиков для подавле­ ния размножения патогенов (вирусов, микроорганизмов и опухолевых кле­ ток) связана с возникновением у них резистентности к определенным анти­ биотикам. Для интенсивно размножающихся клеток, как правило, характерна высокая частота мутаций, некоторые из которых могут привести к потере чувствительности к антибиотику. Поэтому при действии антибиотика подав­ ляется размножение нормальных клеток, но продолжается интенсивное раз­ множение мутантных, нечувствительных к антибиотику, в результате чего лечение становится неэффективным. В этих случаях единственным выходом является смена антибиотика.

Наряду с использованием в терапевтических целях многие антибиотики нашли применение как тонкий инструмент исследования важнейших биоло­ гических макромолекул (§ 19.4).

§ 19.2. Антибиотики, ингибирующие синтез бактериальной клеточной стенки

Первый из открытых антибиотиков был пенициллин (бензилпенициллин, пенициллин G). Пенициллины, относящиеся по химическому строению

к Р-лактамам, синтезируются в грибах родов Penicillium, Cephalosporium, актинобактериях Streptomyces, Nocardia, бактериях рода Pseudomonads. Они

содержат в своей структуре 4-членное кольцо - Р-лактам. В пенициллинах - это Р-лактамтиоазолидиновая система (система пенама), имеющая строго не­ обходимую для биологической активности конфигурацию:

R

§ 19.2. Антибиотики, ингибирующие синтез бактериальной клеточной стенки 411

Пенщимины - нестабильные соединения, в щелочной среде происходит расщепление (5-лактамного кольца с образованием биологически неактивной

пенициллоиновой кислоты:

Эта же реакция происходит под действием Р-лактамаз, выделенных из ус­ тойчивых к пенициллинам штаммов микроорганизмов. Резистентность также может возникать в результате появления в штаммах-мишенях ферментов - ацетилтрансфераз, фосфотрансфераз и аденилтрансфераз, катализирующих специфическую химическую модификацию антибиотика, приводящую к его инактивации.

В связи с распространением резистентных штаммов микроорганизмов пенициллины G и V в 1970-х годах практически утратили свое терапевтическое применение.

Были разработаны химические и ферментативные методы отщепления ос­ татка фенилуксусной кислоты от бензилпенициллина с образованием 6-

аминопенницилановой кислоты

Путем её ацилирования было получено значительное число различных полусинтетических пенициллинов, имеющих, по сравнению с исходным пе­ нициллином, большую активность и устойчивость к Р-лактамазам и более широкий спектр действия.

Из экстракта микроорганизма Cephalosporium acremonium был выделен антибиотик цефалоспорин С, содержащий бициклическую структуру. Сам антибиотик не нашел широкого практического применения, но на его основе были синтезированы производные, обладающие активностью по отношению к резистентным к пенициллинам штаммам бактерий. Наиболее интересны из них цефазолин, цефацетрш и цефаклор:

§ 19.2. Антибиотики, ингибирующие синтез бактериальной клеточной стенки 413

Наличие бициклической системы не является обязательным для проявле­ ния (5-лактамными соединениями биологической активности. Были открыты моноциклические структуры, например, нокардицин А и сульфазецин.

"ООС

Нокардицин А

СН,

и грамотрицательных бактерий. Они являются ингибиторами синтеза бакте­ риальной клеточной стенки, поскольку подавляют активность различных ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки, в то же время не дей­ ствуют на грибы, клеточные стенки которых не содержат пептидогликана.

Предложено несколько механизмов, объясняющих действие Р-лактамных антибиотиков. Один из них заключается в подавлении активности транспеп­ тидаз - ферментов, катализирующих образование пептидных сшивок между полисахаридными цепями пептидогликанов. Это ингибирование, возможно, осуществляется благодаря структурному сходству р-лактамов с D-аланил-О- аланином - субстратом транспептидазной реакции.

Гликопептидные антибиотики - это соединения молекулярной массой 1400-2000 Да, в которых углеводы связаны с линейным гептапептидом, со­ держащим другие заместители, образующие замкнутые в циклы структуры. Первым антибиотиком этой группы был открыт ванкомицин. Он синтезирует­ ся микроорганизмами Amycolatopsis orientalis.

Позднее были открыты антибиотики ристоцетин А и тейкопланин.

Установление столь сложных структур этих антибиотиков стало возможным только после широкого введения в практику органической химии метода ЯМР.

Все известные гликопептидные антибиотики содержат пептидный остов, состоящий из семи аминокислот. Если их пронумеровать от 1 до 7 от N- к С- концу, то окажется, что остатки 4 и 5 всегда построены из р-гидрокси-фенил- глицина. Остатки 2 и 6 - из тирозина, тогда как остаток 7 - это 3,5- дигидроксифенилглицин. Во многих антибиотиках остатки 1 и 3 - алифати­ ческие аминокислоты. Например, остаток 1 - это N-метиллейцин, а остаток 3 - аспарагин (см. ванкомицин). С другой стороны, оба эти остатка могут яв­ ляться ароматическими аминокислотами, как в случае ристоцетина А и тейкопланина. При этом остаток 1 - это /?-гидроксифенил-глицин, а остаток 3 - 3,5-дигидроксифенилглицин (также р-метилированный в случае ристоцети­ на А). Когда остатки в аминокислотах 1 и 3 ароматические, они могут быть соединены друг с другом. Во всех случаях стереохимические конфигурации а-С-атомов аминокислот 1 и 7 были определены как R,R,S,R,R,S,S.

В табл. 21 приведены аминокислотные остатки, образующие гептапепти­ ды, входящие в состав трех антибиотиков ванкомициновой группы. Нумера­ ция аминокислотных остатков приведена на структурах антибиотиков.

Другие структурные особенности, которые варьируются в разных анти­ биотиках этой группы, включают атомы хлора в ароматических кольцах ос­ татков 2 и/или 6 (в ванкомицине и тейкопланине); p-гидроксильные группы в остатках 2 и/или 6 (в ванкомицине и ристоцетине) и остатки сахара, при­ соединенные к боковым цепям аминокислоты 4 (во всех рассмотренных вы­ ше антибиотиках), аминокислот 6 и 7 (в ристоцетине и тейкопланине).

Антибиотики этой группы обладают высокими лечебными свойствами. При большой токсичности для человека они имеют сильное бактерицидное действие в отношении грамположительных микроорганизмов, в том числе устойчивых к другим антибиотикам. Важной особенностью гликопептидов является крайне медленная адаптация к ним микроорганизмов.

В то же время антибиотики этой группы обладают нежелательными по­ бочными действиями (тромбоцитопения, нефротоксичность, некроз тканей в месте введения), что ограничивает их применение в медицине. Применяют­ ся они в случае особо серьезных, вызванных бактериями заболеваний (тяже­ лые пневмонии, сепсис и др.), не поддающихся лечению другими лекарст­ венными средствами. Эти антибиотики вводят внутривенно капельным спо­

NH-Gly5

Рис. 116. Структура мукопептидного предшественника синтеза пептидогликана у бактерий S. aureus

Бактериальная стенка синтезируется на внешней стороне клетки в две стадии (рис. 117). Сначала остатки дисахаридов с подвешенным пептидом доставляются из цитоплазмы наружу клетки (А), где связываются друг с другом ферментом трансгликозидазой (Б). Затем для обеспечения механи­ ческой прочности эти длинные полисахаридные цепи сшиваются через пеп­ тидные остатки ферментом транспептидазой (В). Этот фермент узнает после­ довательность D-Ala-D-Ala на конце пептидной цепи, отщепляет С-концевой аланин и связывает оставшийся остаток с N-концом мостиковой пептидной цепи соседнего олигосахаридного фрагмента.

Ванкомицин, как и ристоцетин, воздействует на пептидогликансинтезирующую систему, специфично связываясь с последовательностью L-Lys-D-Ala-D-Ala боковой цепи одного из связанных с мембраной промежу­ точных продуктов синтеза пептидогликана.

Константы связывания этих антибиотиков с мукопептидным предшест­ венником в водном растворе при комнатной температуре равны ~10 М'1. Ос­ новной вклад вносят следующие нековалентные взаимодействия:

•связывание карбоксилат-аниона С-концевого D-аланина с тремя амидными NH-группами остатков 2, 3 и 4 в адсорбционном кармане антибио­ тика;

•образование двух амид-амидных водородных связей между пептидом

иантибиотиком;

•гидрофобное взаимодействие между метальными группами пептида

иуглеводородными фрагментами антибиотика.

Оценка энергии этих взаимодействий показывает, что первый вклад явля­ ется главным (20-30 кДж/моль). В отсутствие пептида между NH-концами диполей трех CONH-групп существует отталкивание. В присутствии пептида они предпочтительнее взаимодействуют с отрицательно заряженным конце­ вым карбоксилатом, чем с молекулами воды.

§ 19.2. Антибиотики, ингибирующие синтез бактериальной клеточной стенки 419

Рис. 117. Схема синтеза бактериальной клеточной стенки. Транслокация через плазматическую мембрану остатка дисахарида с подвешенным к нему пептидом (А). Соединение дисахаридов друг с другом ферментом трансгликозидазой (Б). Сшивание длинных полисахаридных цепей через пептидные остатки ферментом транспептида­ зой (В)

Изучение ристоцетина А показало, что он образует димеры в водном рас­ творе. Пептидные остовы антибиотика связываются друг с другом четырьмя амид-амидными водородными связями, а четвертичный азот аминосахара при 6-м аминокислотном остатке образует водородную связь с атомом О карбо­ нильной группы противоположной цепи. Отсутствие в ванкомицине амино­ сахара приводит к образованию только 4-х водородных связей. Полная струк­ тура димера ристоцетина А была получена с помощью ]Н-ЯМР и подтвер­ ждена рентгеноструктурным анализом. Среди исследованных антибиотиков этого класса только тейкопланин и несколько его производных не образовы­ вали димеры.

Интересной особенностью процесса димеризации антибиотиков этого класса является увеличение константы димеризации в присутствии аналога предшественника клеточной стенки. Следовательно, димеризация протекает кооперативно со связыванием лиганда, т. е. димер связывает лиганд сильнее, чем мономер. Константа димеризации возрастает в 100 раз в присутствии предшественника. Это означает, что два предшественника клеточной стенки, связываясь с димером с одинаковой аффинностью, должны увеличивать кон­ станту каждого из них, по крайней мере, в 10 раз по сравнению с мономером.