КНОРРЕ_3227

§ 16.3. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции 361

плекса XFe(III), где X - окисляемый субстрат. Объемный лиганд вытесняет также несколько примыкающих к Н20-лиганду молекул воды. Например, при связывании камфоры удаляется шесть молекул воды. Изменение кристалли­ ческого поля, создаваемого лигандным окружением, способствует переходу Fe(III) в высокоспиновое состояние. При этом понижается редокс-потенциал цитохрома Р450, что облегчает последующее восстановление Fe(III) до Fe(II).

На второй стадии происходит первое восстановление с помощью флавопротеида, катализирующего перенос электрона от соответствующего восста­ новителя, чаще всего NADPH. В результате Fe(III) восстанавливается до

Fe(II) с образованием XFe(II).

На третьей стадии происходит образование достаточно прочного ком­ плекса с кислородом (K<j = 0,6x10'6 М), в котором железо переходит в низко­ спиновое состояние. В образовавшемся комплексе XFe(II)(02), по-видимому, происходит обратимое внутримолекулярное окисление, в результате чего об­ разуется частица XFe(III)(02'), которая участвует во второй реакции восста­ новления (четвертая стадия). В результате образуется частица XFe(III)(022‘). Поскольку лиганды, содержащие кислород, могут протонироваться, то на третьей стадии с Fe(II) может быть связан Н02, а на четвертой стадии с Fe(III) может быть связан перекисный анион Н 02".

Образование этих частиц существенно для протекания пятой химической стадии, являющейся первым этапом на пути к разрыву связи О-О, необходи­ мой для оксигенирования субстрата. Этот разрыв должен происходить значи­ тельно легче, чем аналогичный разрыв в исходной молекуле 0 2. Действи­ тельно, энергия разрыва связи в 0 2 составляет 460 кДж/моль, в Н02 - 276, а в Н20 2 - 213 кДж/моль. В результате столь существенного ослабления связи 0 -0 энергия активации реакций, катализируемых цитохромом Р450, является достаточно низкой. Она лежит для разных цитохромов в пределах 4070 кДж/моль. При гетеролитическом разрыве связи 0 -0 с участием двух про­ тонов образуется молекула воды, а субстрат оказывается связанным с части­ цей [Fe(V)=0], т. е. образуется комплекс X[Fe(V)=OJ. В этом комплексе про­ ходит оксигенирование с регенерацией Fe(III) и образованием продукта окси­ генирования ХО. Поскольку в этом случае на молекулу субстрата переносит­ ся частица, эквивалентная синглетному атомарному кислороду, изоэлектронная карбену и нитрену, то эта частица в литературе получила название «оксена», а изложенный выше механизм - «оксеноидным».

Диоксигеназы катализируют реакции окисления молекулярным кислоро­ дом, в которых оба атома кислорода внедряются в субстраты. При этом ак­ цептором кислорода может являться как одна молекула субстрата, так и две, одной из которых может быть NADH или NADPH. При окислении L- триптофана до L-N-формилкинуренина оба атома кислорода внедряются в субстрат:

Реакция катализируется триптофан-2,3-диоксигеназой. Этот фермент со­ держит в своей структуре ферригем.

Диоксигеназы в качестве кофакторов могут содержать гемы или ионы железа негемовой природы, а также ионы меди. В качестве механизма реак­ ции окисления обсуждаются как оксеноидный, так и неоксеноидный, напри­ мер, присоединение молекулы кислорода в системе сопряженных двойных связей. В частности, диоксигеназы пирокатехаза и триптофанпирролаза ката­ лизируют превращение ароматических соединений (обычно фенолов и индолов) в соединения с раскрытым кольцом, которые содержат оба атома кислорода, каждый из которых присоединен к атомам углерода разрываемой С-С-связи:

ОН

х £ ^ С = 0

К группе гемопротеиновых ферментов относятся также пероксидазы, ко­ торые катализируют реакцию:

ХН2 + Н20 2 -> X + 2Н20

где ХН2 - субстрат, служащий в реакции донором электронов, а пероксидводорода - акцептором. Пероксидазы содержатся как в растительных, так и животных тканях. Среди растений их особенно много в соке фигового дерева и в корне хрена. В ходе реакции происходит двухэлектронное окисление суб­ страта и восстановление двух атомов кислорода в пероксиде водорода из со­ стояния окисления (-1) до (-2) в образующихся молекулах воды.

Реакция, катализируемая пероксидазой хрена (HRP - horse radish peroxi­ dase), используется для количественного определения пероксида водорода, выделяющегося в реакции окисления глюкозы кислородом, катализируемой глюкозооксидазой. В этом методе пероксидаза катализирует окисление

люминола (циклического дигидразида 3-аминофталевой кислоты) с образова­ нием 3-аминофталата, часть молекул которого образуется в электронно­ возбужденном состоянии, испускающем кванты света с длиной волны 480 нм, что регистрируется с помощью специальных приборов - люминометров.

N, + 2Н + hv

Пероксидазы способны также проводить оксигенирование определенных субстратов, внедряя в субстрат атом кислорода. Например, такой процесс имеет место при окислении и-замещенных тиоанизолов:

X = Н, СН3, CN, N02 и другие заместители

§16.4. Химия кофакторов некоторых лиаз, трансфераз и лигаз

Внастоящее время механизмы каталитических процессов, лежащие в ос­ нове функционирования кофакторов, установлены для нескольких групп ферментов. В одну из таких групп входят ферменты, в работе которых в ка­ честве кофактора участвуют пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат (осуществляющие пиридоксалевый катализ). Они принимают участие в ре­

акциях переаминирования, в которых субстратами являются две L-a- аминокислоты и соответствующие им a -кетокислоты, причем аминокислота

превращается в кетокислоту, а кетокислота - соответственно в аминокислоту. Стехиометрическое уравнение реакции записывается в виде

NH3+-CHR’-COO‘ + CHR”-CO-COO' ->

-► NН3+-СНR”-COO' + CHR’-CO-COO'

Константа равновесия этой реакции близка к единице, т. е. реакция обра­

группой образует альдимин (основание Шиффа) с е-аминогруппой остатка лизина апофермента. На рис. 106 представлен механизм первой стадии дей­ ствия фермента, установленный для аспартатаминотрансферазы из сердечной мышцы свиньи.

Исходный конъюгат (1) апофермента с пиридоксальфосфатом образует комплекс (2) с субстратом, в котором происходит перенос протона от a-NH3+- группы субстрата на атом N альдимина. Перенос происходит через промежу­ точное связывание протона ионизованной гидроксигруппой, связанной с ароматическим кольцом пиридоксальфосфата. Депротонированная 0 NH2- группа субстрата в комплексе (3) атакует атом С альдиминной группы, в ре­ зультате чего фрагмент R-CH-COO' субстрата оказывается ковалентно свя­ занным с кофактором (4). Создаются благоприятные условия для переноса протона от a-С фрагмента на e-NH2-rpynny апофермента (4). В результате образуется карбанион (5), в котором отрицательный заряд делокализован между атомами С кофактора a-С фрагмента. Перенос протона на С' кофакто­ ра приводит к стабилизации кетиминной формы фрагмента, который реаги­ рует с молекулой воды и превращается в кетимин (6), который в свою оче­ редь гидролизуется с превращением остатка пиридоксальфосфата в пиридоксаминфосфат (7) (см. § 18.2) и образованием свободной кетокислоты (8). По­ следнее означает, что не происходит полной регенерации простетической группы, т. е. процесс не является каталитическим в полном смысле этого слова. В то же время процесс, описываемый приведенной схемой, характери­ зуется высокой специфичностью и большой скоростью, характерными для каталитических процессов. Он становится таковым, если одновременно с а- аминокислотой присутствует a-кетокислота, отличная от (5), которая может пройти в обратном направлении всю цепочку превращений, представленных на рис. 106. При этом образуется новая a-аминокислота, а пиридоксаминфосфат превратится в пиридоксальфосфат, т. е. каталитический цикл замк­ нется.

В реакции переаминирования могут участвовать различные пары амино­ кислот и соответствующих кетокислот. Однако в большом числе случаев од­ ной из пар является пара глутаминовая/а-кетоглутаровая кислоты. Реакции переаминирования играют важную роль в метаболизме аминокислот.

Пиридоксальфосфат является кофактором и многих других ферментов, среди которых следует упомянуть катализаторы декарбоксилирования ами­ нокислот, приводящие к образованию соответствующих аминов. Уравнение катализируемых реакций можно записать в виде

NH3+-CHR -CO O ' CH2R -NH3+ + С 0 2.

Важным кофактором, входящим в состав некоторых ферментов, катали­ зирующих декарбоксилирование а-кетокислот, является тиаминпирофосфат, структура которого приведена в § 18.2. На рис. 107 представлена схема де­ карбоксилирования пирувата при участии тиаминпирофосфата.

Процесс приводит либо к превращению пирувата в ацетальдегид по сум­ марной реакции

СНзСОСОО ' -» СНзСНО + С 0 2,

либо к присоединению остатка СН3СО к атому серы дисульфидного мостика липоата с образованием тиоацетильного фрагмента. Последний является до­ нором ацетила при образовании ацетилированного кофермента А, который вводит ацетильные остатки в цикл трикарбоновых кислот и в биосинтез жир­ ных кислот. Основное участие в реакции декарбоксилирования принимает тиазольное кольцо кофактора. В реакции оно участвует в виде карбаниона, причем атом С последнего атакует атом С кетогруппы субстрата.

Важной реакцией является карбоксширование (присоединение СОг). Ко­ фактором этой реакции в ряде случаев является биотин, структура которого приведена в § 18.2. Биотин связан ковалентно с апоферментом через остаток валериановой кислоты. Реакция карбоксилирования будет рассмотрена на примере карбоксилирования пирувата (рис. 108), которая приводит к образо­ ванию оксалоацетата, одного из участников цикла трикарбоновых кислот. Карбоксилирование проходит сопряженно с гидролизом АТР до ADP.

о—с—он

А ТР

V».ADP

Рис. 108. Схема карбоксилирования пирувата, катализируемого пируваткарбокси-

лазой (КФ 6.4.1.1)

Субстратами этой реакции являются пируват, бикарбонат-анион и АТР. Реакция начинается с фосфорилирования бикарбоната с образованием сме­ шанного ангидрида угольной и фосфорной кислот. За этим следует перенос остатка С 02 на один из атомов N фрагмента мочевины биотина. В таком виде фермент катализирует перенос С02 на метальную группу пирувата.

§16.5. Рибозимы

Вначале восьмидесятых годов произошло одно из наиболее неожидан­ ных событий в развитии биохимии - было найдено, что в природе существу­ ют катализаторы, лишенные белка и состоящие только из РНК. До этого су­ ществовало убеждение, основанное на огромном множестве биохимических данных, что обязательным, а в большом числе случаев единственным компо­ нентом всех ферментов является белок. Открытие каталитических функций РНК было осуществлено в начале 80-х годов XX века двумя группами иссле­ дователей. Первая из них под руководством Томаса Чека (Cech) занималась