КНОРРЕ_3227

Для защиты гидроксигрупп в тирозине при использовании Вос- аминокислот требуется повышенная устойчивость защищенной ОН-группы, которая должна выдерживать многократную обработку кислотой при удале­ нии защиты на каждой стадии. Поэтому предпочтительной, по сравнению с бензильной группой, для защиты гидроксигруппы остатков тирозина явля- ет-ся 2,6-дихлорбензильная группа, эфир которой в 50 раз устойчивее, чем 0 -бензиловый эфир.

Для защиты остатков аргинина в твердофазном синтезе широкое приме­ нение находит А^-толуол-и-сульфонильная группа, дающая особенно устой­ чивые производные.

и-Толуолсульфонильная группа может быть удалена только при действии очень сильной кислоты (жидкого фтористого водорода) или путем восста­ новления натрием в жидком аммиаке.

Для автоматического твердофазного синтеза пептидов созданы специаль­ ные синтезаторы пептидов. По принципу работы они сходны с генсинтезаторами, но, в отличие от последних, содержат 20 вместо четырех со­ судов для мономеров. Кроме хлорметильных, в качестве «якоря» для присое­ динения первой аминокислоты к полимерному носителю используют другие группы (табл. 17). С целью повышения кислотоустойчивости «якорных» групп, связывающих пептид с полимером, при использовании в процессе синтеза пептида Вос-защищенных аминокислот применяются полимерные смолы с фенилацетамидометильными группами. Если в качестве временной защиты используется Fwoc-защита, то первый аминокислотный остаток при­ соединяют к смоле, содержащей щелочеустойчивую «якорную» группировку, например 4-метоксибензильный остаток. Но в ряде случаев при синтезе тре­ буется получить пептид с защитой на С-конце. Для этого используют «якор­ ные» группы, в которых присутствуют два типа связей, расщепляемых в раз­ ных условиях, например 4-[4-(гидроксиметил)феноксиметил]-3-нитробенз- амидометильная смола. Для получения С-концевого амида первый амино­ кислотный остаток присоединяют к «-нитробензгидриламидной смоле.

Первую защищенную аминокислоту к гидразидной смоле присоединяют через амидную связь карбодиимидным методом. Далее получают пептид вышеописанным твердофазным методом синтеза. В качестве временной № - защитной группы используют 2-(»-дифенил)пропил-(2)-оксикарбонильную группу (Врос). Условия отщепления Врос-группы (0,5 % CF3COOH в CH2CI2, 12 мин, 25 °С) являются достаточно мягкими, поэтому расщепление амидной связи на полимере минимально (< 0,2 %). Синтезированный гидразид защи­ щенного пептида отщепляют от полимера путем 30-минутной обработки

50 % CF3COOH в CH2CI2 при 25 °С в течение 30 мин.

Впервые твердофазный метод был применен Р. Меррифилдом для синте­ за брадикинина. Брадикинин - это тканевый гормон, представляющий собой пептид Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Он образуется в плазме крови из неактивного предшественника и оказывает регулирующее действие на кро­

ционально значимых фрагментов белков, например, выявления антигенных детерминант белков. Если чип содержит пептиды, перекрывающие всю ами­ нокислотную последовательность белка, то с помощью антитела к этому бел­ ку можно выявить, какие из пептидов взаимодействуют с антителом, и тем самым определить аминокислотную последовательность, взаимодействую­ щую с антителом, т. е. антигенную детерминанту. Обычно с этой целью ис­ пользуется производное антитела, несущее флуоресцентную метку. Положе­ ние комплекса такого производного с иммобилизованным пептидом позволя­ ет определить данный пептид по положению флуоресцентной метки, по­ скольку каждый из иммобилизованных пептидов имеет определенное поло­ жение на матрице.

Пептидные чипы, как и олигонуклеотидные, могут быть получены мето­ дом фотолитографии, основанном на использовании при синтезе аминокис­ лот с а-аминогруппами, несущими светолабильную (удаляемую фотохими­ чески) защиту, например, описанную в § 10.5 1-(2-нитро-4,5-метилендиокси- фенил)этил-1 -оксикарбонильная группу.

Эта группа может быть удалена только при действии очень сильной ки­ слоты (жидкого фтористого водорода) или путем восстановления натрием в жидком аммиаке.

Применительно к пептидам также используются подходы комбинаторной химии. Например, могут быть получены чипы, на которые нанесен набор пептидов определенной длины, представляющих все последовательности аминокислот какого-либо белка. Выявление пептидов, взаимодействующих с антителом, выработанным в ответ на введение в организм этого белка, по­ зволяет определить его антигенную детерминанту.

§ 10.10. Образование дисульфидных мостиков в синтетических пептидах

Поскольку многие пептиды и белки содержат дисульфидные мостики, после завершения синтеза полипептидной цепи необходимо образовать эти мостики. В простейшем случае нужно внутримолекулярно окислить два ос­ татка цистеина. Для этого необходимо сначала освободить временно блоки­ рованные остатки цистеина, затем связать их между собой. С этой целью ис­ пользуется несколько окислителей: I2, Hg(CH3COO)2, Tl(CF3COO)3 и ряд дру­ гих. Чтобы избежать сопровождающего окислительного повреждения остат­ ков метионина, тирозина и триптофана, предложен также вариант неокисли­ тельного образования S-S-мостиков. В этом случае при синтезе пептида с двумя остатками цистеина по этим остаткам вводятся две разные защиты, одна из которых - монометокситритильная (Mmt), а вторая - какая-либо группа, удаляемая в условиях, более мягких, чем Mmt, например третбуттъная. После селективного удаления этой защиты получается пептид, содержащий одну S-Mmt- и одну SH-группу. Последняя активируется добав­

лением 2,2’-дитиобис(5-нитропиридина) с образованием производного остат­ ка цистеина, у которого атом S связан дисульфидным мостиком с остатком 5- нитро-пиридина. Активированный таким образом атом S остатка цистеина вытесняет остаток Mmt с образованием дисульфидного мостика (рис. 77).

Главным осложнением при образовании дисульфидных мостиков у пеп­ тида (белка) всего двух остатков цистеина является возможность образования

Н20

Рис. 77. Схема образования дисульфидного мостика (неокислительный вариант)

мостика между двумя остатками цистеина, принадлежащими двум разным полипептидным цепям. Чтобы избежать этого, следует проводить окисление в достаточно разбавленном растворе.

Задача существенно осложняется, если в конечном продукте должно быть несколько дисульфидных мостиков между строго определенными остатками цистеина. Например, панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза) содержит во­ семь остатков цистеина, связанных попарно четырьмя мостиками. При хими­ ческом синтезе РНКазы получается полипептид с восемью защищенными SH-группами. После их деблокирования возникнет восемь SH-групп, которые могут теоретически попарно соединиться в 105 вариантах (7x5x3). Этого уда­ ется избежать, если поочередно деблокировать пары определенных групп и соединять их S-S-связями перед освобождением следующей пары. Для это­ го первая пара должна быть защищена группами, которые можно селективно удалить, не затрагивая защит остальных SH-групп. То же относится и к по­ следующим парам. В качестве примера такой процедуры можно привести синтез пептида

группами, удаляемыми в более жестких условиях, чем я-метокситритильные. В рассматриваемом случае первый мостик образовывался по описанной вы­ ше неокислительной реакции между остатками цистеина. Для этого при син­ тезе пептида один из двух остатков цистеина защищали MwZ-группой, а дру­ гой - /wpew-бутильной. Последнюю можно было избирательно деблокиро­ вать и активировать с помощью 2,2’-дитиобис(5-нитропиридином) (DTNB). После образования S-S-мостика в более жестких условиях (95 % CF3COOH вместо 1 % в дихлорэтане) удалялись 7>/-группы с двух крайних остатков цистеина, после чего две освободившиеся SH-группы окислялись до S-S- мостика.

Глава 11. Химические методы получения производных белков

инуклеиновых кислот (дериватизация). Методы и задачи

§11.1. Иммобилизация биополимеров на нерастворимых носителях

Биополимеры, выполняющие специфические биологические функции, могут представлять большой интерес как инструменты биохимических ис­ следований. Ферменты используются в биоорганической химии и технологии для направленного проведения определенных химических превращений. Они также находят широкое применение для анализа сложных смесей. Монокло­ нальные антитела стали незаменимым инструментом для идентификации белков. Поли- и олигонуклеотиды с определенной последовательностью мо­ номерных звеньев позволяют выявлять белки, взаимодействующие с такими последовательностями, и комплементарные структуры в анализируемых нук­ леиновых кислотах.

Многие из препаративных и аналитических процедур существенно упро­ щаются, если используемый биополимер оказывается в виде твердой фазы. Получение такой фазы достигается путем присоединения биополимера к не­ растворимому носителю, т. е. иммобилизации биополимера. Иммобилизация может быть достигнута путем физической сорбции биополимера на нерас­ творимом носителе. Еще одним вариантом является захват биополимера в поры геля. Это может быть достигнуто проведением полимеризации моно­ меров, формирующей гель, в растворе, в котором одновременно находится подлежащий захвату биополимер. Однако в большинстве случаев предпочти­ тельной является более прочная ковалентная иммобилизация.

Иммобилизованные биополимеры, как правило, используются как непод­ вижное вещество, через которое проходит поток растворителя, содержащего растворенные вещества, предназначенные для взаимодействия с биополиме­ ром. Поэтому носитель должен обладать достаточной механической прочно­ стью, проницаемостью, хорошими гидродинамическими свойствами, хими­ ческой и биологической устойчивостью, низким уровнем неспецифической сорбции.

В настоящее время предложено большое число разнообразных носителей, многие из которых являются коммерческими продуктами. Они являются либо продуктами полимеризации, либо получаются из природных полисахаридов.

Цепной свободно-радикальной полимеризации легко подвергаются моно­ меры, содержащие винильную группу - стирол и акриламид. Образующиеся при полимеризации линейные полимеры растворимы и неудобны для исполь­ зования в качестве носителей. Для придания им нерастворимости линейные цепи, образующиеся при полимеризации, соединяют между собой (сшивают),

248 Глава 11. Химические методы дериватизации белков и нуклеиновых кислот

что достигается введением в реакционную смесь контролируемого количест­ ва мономера, содержащего две винильные группы: в случае стирола - дивинилбензол, в случае акриламида - метиленбисакриламид. Такие бифунк­ циональные реагенты при полимеризации входят в состав двух цепей, в ре­ зультате чего между этими цепями возникает ковалентная сшивка. В силу статистического характера распределения сшивающих фрагментов каждая цепь оказывается ковалентно связанной с несколькими цепями и все множе­ ство цепей оказывается соединенным в одну гигантскую и, естественно, не­ растворимую молекулу. В качестве примера ниже приведен фрагмент такого сшитого полиакриламида.

Широкое применение в качестве носителей для иммобилизации биополи­ меров нашли природные полимеры. Среди них по широте применения первое место занимает агароза, представляющая собой сополимер чередующихся остатков D-галактозы и 3,6-ангидро-Ь-галактозы (§ 13.1).

В каждом звене агароза имеет свободные ОН-группы, которые частично могут быть использованы для сшивания углеводных цепей, что придает сор­ бенту повышенную устойчивость, а частично - для связывания с биополиме­ ром. Сшитая, приготовленная в виде шариков коммерческая форма агарозы называется сефарозой.

Широко используемым реакционноспособным носителем является акти­ вированная обработкой бромцианом агароза (бромциансефароза). Она легко реагирует с аминогруппами и, таким образом, может иммобилизовать разно­ образные биополимеры, несущие эти группы.

§11.1. Иммобилизация биополимеров на нерастворимых носителях 249

Среди природных полимеров в качестве носителей нашли широкое при­ менение также целлюлоза (§ 13.4) и декстран. Часть ОН-групп декстрана мо­ жет быть использована для сшивания между цепями. Ниже приведен фраг­ мент декстрана, сшитый с помощью 1-хлор-2,3-эпокспропана.

О

Применяются также носители на основе двуокиси кремния - пористое стекло, силикагель и цеолиты.

В настоящее время исследователям практически не приходится иметь де­ ло с получением носителей. Как правило, носители являются коммерческими