КНОРРЕ_3227

ние ангидрида протекает даже при соотношении ДЦК и карбоксильной груп­ пы iV-защищенной аминокислоты 1:1, поскольку карбоксильная группа реа­ гирует с О-ацилизомочевиной быстрее, чем с ДЦК.

Кроме того, происходят побочные реакции, приводящие к нереакционно­ способным побочным продуктам.

Вприсутствии других нуклеофилов протекающие с ними реакции О- ацилизомочевины уменьшают уровень приведенных выше побочных пре­ вращений. Условия, в которых предпочтительно протекает межмолекулярная нуклеофильная атака О-ацилизомочевины, способствуют уменьшению числа побочных реакций и, следовательно, приводят к получению более чистого конечного продукта, содержащего значительно меньшие количества 5(4Н)- оксазолона или TV-ацилмочевины.

Врастворителях с низкими значениями диэлектрической проницаемости (СС14, СН2С12, С6Н6) образуется значительно меньшее количество N- ацилмочевины, чем в полярных средах (Л/^-диметилформамид (ДМФА), ацетонитрил, диметилсульфоксид (ДМСО), Н20). Это объясняется тем, что

внеполярных растворителях карбоновые кислоты находятся преимущест­ венно в виде димеров. Например, константа ассоциации уксусной кислоты

вСС14 имеет порядок 2000, тогда как в ацетонитриле - только 0,5. Димеры реагируют с ДЦК в 30 раз быстрее, чем мономеры, образуя с высоким выхо­ дом ангидриды и почти не давая А^-ацилмочевину.

О-ацилизомочевина, образованная аспарагином, может подвергаться внутримолекулярной циклизации по реакции

+ о=с

NH

II

NH

§10.4. Метод активированных сложных эфиров

Вначале 1950-х годов для активации карбоксильной группы в пептидном синтезе был предложен новый способ, основанный на использовании слож­ ных эфиров с хорошей уходящей группой, т. е. активированных эфиров (ме­ тод активированных эфиров). Впервые этот метод был осуществлен на при­

мере я-нитротиофениловых эфиров аминокислот. В дальнейшем в связи с неприятным запахом «-нитротиофенола, выделяющегося в результате реак­ ции аминолиза, стали использоваться другие нитрофениловые эфиры.

N02

no2 no2

Наибольшее распространение при синтезе пептидов получили «-нитро­ фениловые эфиры. Особых различий в скоростях ацилирования производны­ ми мононитрозамещенных фенолов не наблюдается, однако при их получе­ нии «-нитрофениловые эфиры защищенных аминокислот кристаллизуются лучше других. Высокая стабильность при хранении позволила выпускать коммерчески доступные «-нитрофениловые эфиры защищенных аминокис­ лот. 2,4-Динитрофениловые эфиры оказались чрезвычайно активными и вследствие этого весьма чувствительными к гидролизу.

Широкое распространение в пептидном синтезе получили и другие ари­ ловые эфиры. Структурные формулы арильного остатка и реакционная спо­ собность сложных эфиров (константа скорости ацилирования ко) представле­ ны в табл.15.

ранирования атома углерода карбонильной группы, так как ван-дер-ваальсов радиус атома фтора значительно меньше, чем у хлора, и ненамного больше, чем у водорода. В связи с этим лучшими в серии сложных эфиров на основе галогензамещенных фенолов можно считать пентафторфениловые эфиры.

Поскольку атомы фтора проявляют сильный электроноакцепторный эф­ фект и в то же время не создают стерических препятствий, пентафторфени­ ловые эфиры можно применять для проведения реакции в пространственно­ затрудненных условиях, например, при твердофазном синтезе. В настоящее время пентафторфениловые и N-гидроксисукцинимидные эфиры являются наиболее широко используемыми вариантами активации карбоксильной группы в аминокислотах при проведении синтеза на полимерных носителях.

Галогензамещенные фениловые эфиры, в отличие от нитропроизводных, предпочтительно использовать, если в ходе синтеза удаление таких защит­ ных групп, как бензилоксикарбонильные, проводится путем гидрогенолиза, поскольку в противном случае из остаточных количеств «-нитрофенола по­ лучается высокореакционноспособный «-аминофенол.

Активированные эфиры - очень удобные реагенты для синтеза пептидов. Основным их достоинством является то, что, в отличие от смешанных ангид­ ридов, они выдерживают длительное хранение и могут быть приготовлены заранее и поэтому выпускаются как коммерческие продукты. Применяя из­ быток активированного эфира (30-50 %), можно достичь практически коли­ чественного выхода желаемого продукта на каждой стадии процесса. Избы­ ток активированных эфиров можно удалять после окончания реакции добав­ лением А^А^-диметилэтилендиамина. При ацилировании этого амина непро­ реагировавшим эфиром образуется соединение, способное легко растворять­ ся в кислотах и поэтому без труда удаляемое при промывках растворами кислот.

Для получения ариловых эфиров защищенных аминокислот используют ДЦК. Реакция между защищенной аминокислотой, ДЦК и нуклеофилом, на­ пример, «-нитрофенолом, может протекать по двум различным механизмам: 1) через взаимодействие «-нитрофенола с О-ацилизомочевиной и 2) через взаимодействие «-нитрофенола с симметричным ангидридом, образующимся в качестве промежуточного продукта. Если реализуется второй механизм, то аминокислота, освобождающаяся при его реакции с «-нитрофенолом, вновь реагирует с ДЦК, образуя в итоге активированный эфир аминокислоты и Л^ТУ’-дициклогексилмочевину (ДЦГМ). Эти же продукты образуются и при альтернативном механизме.

§ 10.5. Защитные группы в пептидном синтезе. Блокирование ог-аминогрунп

При проведении ступенчатого синтеза пептидов по а-аминогруппам ис­ ходных или активированных по карбоксильным группам аминокислот долж­ ны вводиться временные защиты. За период становления и развития работ по пептидному синтезу было разработано и применено большое число различ­ ных временных защит. Наиболее широкое применение нашли защитные группы уретанового типа. Подобные группы в кислой среде легко гидроли­ зуются с последующим самопроизвольным декарбоксилированием образо­ вавшегося на N-конце остатка карбаминовой кислоты по схеме

со

Первой нашедшей широкое применение временной защитной группой этого типа была бензшоксикарбонтьная группа (Cbz или Z). Она вводится обработкой аминокислоты карбобенилоксихлоридом. Последний может быть получен путем насыщения бензилового спирта фосгеном.

В настоящее время этот тип защиты по а-аминогруппам практически не используется, поскольку более удобным оказалось применение третбутипоксикарбонилъной (Вое) группы, которая вводится обработкой амино­ кислоты отре/я-бутилпирокарбонатом (ВосгО). Поскольку реакция проходит только с депротонированной аминогруппой, ее проводят в присутствии силь­ ного основания.

Эта защита удаляется при более мягких условиях, чем Cbz-группа. Второй широко используемой защитной группой является 9-флуоренш-

метшоксикарбонтъная (Fmoc). Она вводится с помощью 9-флуоренил- метилазидоформиата.

Fmoc-группа стабильна в кислой среде, но отщепляется основаниями: пи­ перидином, морфолином и др. В результате сильного электроноакцепторного эффекта бензольных колец атом водорода, находящийся в девятом положе­ нии, приобретает кислый характер и легко отрывается основаниями. Это ве­ дет к возникновению карбаниона. Легкость деблокирования определяется в данном случае стабильностью карбаниона, который образуется путем Р-элиминирования. Стабильность карбаниона обусловлена делокализацией

218Глава 10. Химический синтез пептидов и белков

§10.6. Блокирование а-карбоксильных групп

Блокирование С-концевых карбоксильных групп в современных методах пептидного синтеза имеет существенно меньшее значение, чем блокирование а-аминогрупп, и необходимо лишь при гомогенном синтезе коротких пепти­ дов. Образование новых пептидных связей проводится путем реакции акти­ вированной карбоксильной группы С-компонента с незащищенной амино­ группой N-компонента, и, естественно, активируемая карбоксильная группа защите не подлежит. При твердофазном пептидном синтезе (§ 10.9) С-конце- вая карбоксильная группа синтезируемого пептида используется для связы­ вания его с полимерным носителем, т. е. защищена самим носителем. Только при получении коротких пептидов, в том числе для их последующего ис­ пользования в блочном синтезе, С-концевая СООН-группа должна быть снабжена какой-либо временной защитой.

Для защиты С-концевого карбоксила широко используется его этерификация. Это достигается пропусканием безводного хлористого водорода через раствор аминокислоты в абсолютном метаноле или этаноле. Согласно обще­ принятому механизму реакции на первой стадии карбоксильная группа протонируется. Это повышает чувствительность к нуклеофильному реагенту, т. е. к соответствующему спирту.

Оон

Более удобным является этерификация в присутствии хлористого тионила по схеме:

Омыление метиловых и этиловых эфиров проводят при комнатной тем­ пературе в водно-спиртовых растворах едкого натра или в смеси NaOH с та­ кими органическими растворителями, как ацетон, метанол, диоксан. Предпо­ лагается, что реакция идет по следующему механизму:

II

Z - N H - C H - C - O C b L

*1

'ОН

§ 10.7. Блокирование боковых групп в аминокислотах

Степень блокирования боковых групп - важный вопрос при планирова­ нии синтеза. Его решение зависит от растворимости индивидуальных пепти­ дов и от выбора методов конденсации. Боковые функции аспарагина, глута­ мина, серина, треонина, тирозина, аргинина и гистидина могут оставаться незащищенными (например, при использовании метода активированных эфиров). Боковая аминогруппа лизина, сульфгидрильная группа цистеина, индольный гетероцикл триптофана и боковые карбоксильные группы аспартата и глутамата должны защищаться при любой стратегии синтеза.

Полное блокирование всех функциональных групп, т. е. максимальная защита, оптимально способствует предотвращению нежелательных побоч­ ных реакций и обеспечивает свободу выбора методов конденсации. Однако некоторые используемые в настоящее время защитные группы вызывают та­ кой нежелательный эффект, как понижение растворимости крупных пепти­ дов в органических растворителях. В то же время одно из главных преиму­ ществ минимальной защиты, особенно важное для промышленного произ­ водства пептидов и для синтеза крупных пептидов и белков, состоит в боль­ шей легкости удаления небольшого количества защитных групп при получе­ нии желаемого свободного пептида в конце синтеза.