КНОРРЕ_3227

Двунитевые структуры наиболее характерны для ДНК. Однако известны отдельные вирусы, в основе которых лежит двунитевая РНК, структура кото­ рой достаточно сильно отличается от структуры В-ДНК. Эту структуру назы­ вают А-РНК. Двойная А-спираль также является правой, но наклон плоско­ сти комплементарных гетероциклов по отношению к оси спирали сущест­ венно выше, чем в случае В-ДНК, и составляет около 20° Благодаря этому расстояние между плоскостями пар гетероциклов меньше, чем в случае В-ДНК, и составляет около 2,5 нм. Структуры А и В отличаются по конформации пентозы. У В-ДНК дезоксирибоза имеет конформацию С-2’-эндо, а рибоза в соста­ ве А-РНК - 3’-эндо-конформацию. Число пар нуклеотидов на один виток - около 11. Однако такие структуры в РНК образуются в основном в составе однонитевых РНК, которые рассматриваются в следующем разделе.

Для двунитевых ДНК имеется еще одна специфическая особенность. При наличии в составе ДНК фрагментов, в которых чередуются пуриновые или пиримидиновые нуклеотиды, например, d(GC)„, при достаточно высокой ионной силе наблюдается переход этого фрагмента в левоспиральную кон­ формацию, причем повторяющимся фрагментом в этом случае оказывается динуклеотид d(pGpC) (рис. 33).

снг о -

\

НС

\ 5*

сн.

\2

о \

Рис. 33. Структура G C пары в составе Z-ДНК

Линия, соединяющая между собой фосфаты, не является винтовой, а име­ ет зигзагообразную форму, в связи с этим образующаяся пространственная структура называется Z-ДНК. В составе этой структуры G имеет син- конформацию, а С - акти-конформацию. Фактически полному обороту спи­ рали соответствует 6 динуклеотидов d(pGpC), т. е. на полный оборот спирали приходится 12 пар нуклеотидов. Фрагмент дезоксирибозы для С имеет

2’-эндо-, а для G - 2’-экзо-конформацию. На рис. 33 приведена структура од­ ной G C пары в составе Z-ДНК.

4.1.4. Трех- и четырехнитевые структуры

В большой бороздке ДНК может располагаться еще одна полинуклеотидная цепь. Однако достаточно прочная структура образуется лишь в уникаль­ ном случае, если в одной из нитей двойной спирали присутствуют только пу­ риновые, а в другой - только пиримидиновые нуклеотиды. В простейшем случае, если речь идет о полиадениловой последовательности и комплемен­ тарной ей полиуридиловой или политимидиловой последовательности, мо­ жет образоваться трехнитевая структура (триплекс) с участием еще одной полипиримидиновой последовательности, которая ориентирована параллель­ но полиадениловой последовательности. На рис. 34 приведено взаимное рас­ положение трех гетероциклов в плоскости, перпендикулярной трехнитевой структуре. Такая же структура может получиться на основе двойной спирали, образованной полигуаниловой и полицитидиловой последовательностями, но одна из полицитидиловых последовательностей триплекса должна содержать протонированные остатки цитозина и может образовываться лишь в слабоки­ слой среде.

R

Рис. 34. Взаимное расположение взаимодействующих между собой гетероциклов в трехнитевой структуре нуклеиновых кислот в плоскости, перпендикулярной оси спирали

Примером структуры еще более высокого порядка может быть представ­ ленная на рис. 35 четырехнитевая структура, образуемая в результате взаи­ модействия в одной плоскости четырех остатков гуанина.

Такая структура может реализоваться либо при взаимодействии четырех параллельно ориентированных цепей, либо при антипараллельной взаимной ориентации каждой пары соседних нитей.

§ 4.2. Однонитевые нуклеиновые кислоты. Шпилечные структуры. Псевдоузлы 93

G=G

G=G

Рис. 35. Взаимное расположение остатков гуанина в плоскости, перпендикуляр­ ной оси нуклеиновой кислоты в четырехнитевой полигуаниловой кислоте

§ 4.2. Однонитевые нуклеиновые кислоты. Шпилечные структуры. Псевдоузлы

Комплементарные последовательности могут встречаться и в однонитевых структурах. Если эти последовательности антипараллельны, то это мо­ жет привести к образованию так называемых «шпилек», состоящих из дву­ спирального стебля, образованного этими последовательностями, и соеди­ няющей их петли из нескольких нуклеотидных остатков. Шпилечные струк­ туры наиболее характерны для рибонуклеиновых кислот, поскольку ДНК преимущественно существует в виде комплекса, образованного двумя ком­ плементарными, не связанными между собой ковалентно полинуклеотидными цепями.

Кроме того, большое значение для пространственной структуры РНК имеют псевдоузлы. Петли РНК могут в ряде случаев оказаться комплемен­ тарными некоторым, достаточно близко расположенным однонитевым фраг­ ментам. Если между ними образуются водородные связи, то возникает спе­ цифический элемент пространственной структуры, называемый псевдоузлом.

До последнего времени пространственные структуры были в основном установлены для транспортных РНК, многие из которых в силу небольшого размера удалось закристаллизовать и провести их рентгеноструктурный анализ.

94 Глава 4. Пространственная структура нуклеиновых кислот

Таким образом, пространственная структура РНК определяется в первую очередь шпильками и псевдоузлами. При этом следует отметить, что у стеб­ лей, формирующих элементы вторичной структуры РНК, довольно часто имеются пары G-U вместо пар GC.

Стебли в молекулах РНК не всегда являются совершенными. В них при­ сутствуют дополнительные нуклеотиды, как бы выступающие из стебля, что уменьшает его стабильность.

Вопрос о пространственной структуре одноцепочечных рибонуклеино­ вых кислот наиболее подробно изучен для транспортных рибонуклеиновых кислот - тРНК. Установление первичной структуры большого числа транс­ портных РНК показало, что все они построены таким образом, что у них име­ ется три пары комплементарных фрагментов, разделенных каждая участком

внесколько нуклеотидных остатков, не имеющих партнеров для образования сколь-нибудь протяженных комплементарных участков. В результате в про­ странственной структуре тРНК имеются три шпильки: D-шпилька, в которой обычно располагается минорный нуклеозид дигидроуридин; антикодоновая шпилька - в ее петлевой части находится тринуклеотид, называемый антико­ доном, который в ходе биосинтеза белка на рибосомах непосредственно взаимодействует с кодоном мРНК, подлежащим трансляции; Т-шпилька -

вней в подавляющем большинстве тРНК находится метилированный в по­ ложении 5 остаток уридина, т. е. рибоаналог тимидина.

Кроме того, начало полинуклеотидной цепи (5’-концевая часть) компле­ ментарно последовательности, непосредственно примыкающей к противопо­ ложному концу цепи, на котором находится универсальный для всех тРНК тринуклеотид рСрСрА, к одной из его концевых ОН-групп присоединяется карбоксильная группа аминокислоты. Это дало основание приписать всем тРНК вторичную структуру, получившую название клеверного листа (рис. 36).

Размеры каждого из стеблей и каждой из петель практически универсаль­ ны для всех тРНК, независимо от того, каким аминокислотам они соответст­ вуют и из каких биологических источников они выделены, хотя известны

иотдельные исключения.

Следует отметить, что, как видно из структуры акцепторного стебля, комплементарные последовательности, образующие стебель, совсем не обя­ зательно должны быть на коротком расстоянии друг от друга вдоль цепи. В этом случае стебель образован 5’- и 3’-концевыми последовательностями молекулы тРНК, которые вдоль полинуклеотидной цепи разделены последо­ вательностями десятков нуклеотидов. Основываясь на этих соображениях, предположительно можно найти элементы вторичной структуры и в больших молекулах РНК, например, в рибосомных РНК. При поиске возможных ком­ плементарных последовательностей в таких молекулах РНК, состоящих из тысяч нуклеотидных остатков, приходится прибегать к компьютерному по­ иску (поиску структур, обладающих минимальной энергией), в результате которого обычно получается несколько вариантов вторичной структуры, все

§ 4.2. Однонитевые нуклеиновые кислоты. Шпилечные структуры. Псевдоузлы 95

C=G

К 70

Рис. 36. Структура тРНК фенилаланина в форме клеверного листа

они носят гипотетический характер. Пример такой структуры, полученной с использованием биоинформатики, приведен в гл. 20.

Дополнительную информацию можно получать, применяя некоторые другие методы. Одним из них является использование бифункциональных реагентов, несущих на своих концах реакционноспособные группы. Если ре­ акция исследуемой РНК проходит по случайному остатку, то вторая реакци­ онноспособная группа оказывается расположенной вблизи соседнего с пер­ вым участком РНК. Проведя гидролиз РНК до фрагментов небольшой длины и выделив из полученной реакционной смеси модифицированные олигонук­ леотиды, нетрудно установить, в каких участках первичной структуры РНК они находятся, и, таким образом, получить информацию о взаимном распо­ ложении этих участков в структуре РНК, т. е. выявить один из элементов ее пространственной структуры. Что касается полной пространственной струк-

96 Глава 4. Пространственная структура нуклеиновых кислот

туры (третичной), то пока удалось установить эти структуры только для не­ скольких тРНК и рибосомной РНК из Escherichia coli.

Рентгеноструктурный анализ, проведенный двумя группами ученых в США (Рич) и Англии (Клуг) для специфичной к фенилаланину тРНК из дрожжей, полностью подтвердил существование описанных выше шпилек и стеблей, но одновременно показал, что благодаря некоторым дополнитель­ ным взаимодействиям трехмерная структура тРНК имеет L-образную форму (рис. 37).

Рис. 37. Пространственная структура тРНК

Сходная пространственная структура была позднее найдена для несколь­ ких тРНК. Многочисленные данные указывают, что в своих общих чертах такая структура является универсальной для всех тРНК. Важнейшим среди взаимодействий, стабилизирующих третичную структуру тРНК, является, в первую очередь, стекинг соответствующих пар оснований в акцепторном и Т-стеблях и в антикодоновом и D-стеблях, в результате чего четыре корот­ ких двуспиральных фрагмента складываются в два более протяженных, каж­ дый из которых имеет в одной из цепей разрыв. Кроме того, имеется сущест­ венное взаимодействие между гетероциклами Т- и D-шпилек, а именно меж­ ду гуанином в положении 15 D-петли и цитозином 48 в основании Т-стебля,

гуанином 18 D-петли и урацилом псевдоуридина 55 Т-петли и гуанином 19 D-петли и цитозином 56 Т-петли. Схема взаимодействия приведена на рис. 38.

Н

Рис. 38. Взаимодействия, стабилизирующие третичную структуру тРНК

Видно, что только последнее из перечисленных трех взаимодействий яв­ ляется Уотсон - Криковским. Для образования третичной структуры этот тип взаимодействий между гетероциклами никаких явных преимуществ по срав­ нению с другими мыслимыми взаимодействиями не имеет, так как для фор­ мирования третичной структуры тРНК не требуется образования периодиче­ ской структуры остова.

§ 4.3. Применение химической модификации для изучения пространственной структуры нуклеиновых кислот

Реакционные способности однотипных нуклеотидных остатков по отно­ шению к определенному реагенту могут существенно различаться в зависи­ мости от их расположения в пространственной структуре и участия во взаи­ модействии с белками. Поэтому химическая модификация нуклеиновых ки­ слот по гетероциклам широко используется для изучения пространственной структуры нуклеиновых кислот и их комплексов с белками. Как уже говори­ лось во введении, химическая реакция становится в этом случае инструмен­ том исследования.

Наибольшее применение нашли химические реакции с нуклеиновыми ки­ слотами для выявления участков, образующих двуспиральные фрагменты. На таких участках реакционная способность гетероциклов оказывается во много раз ниже, чем у тех же гетероциклов в неспирализованных фрагментах. Это позволяет выявлять элементы вторичной структуры для больших молекул РНК, в частности рибосомных РНК. В качестве иллюстрации на рис. 39 пред­ ставлена вторичная структура одного из доменов 28S РНК мыши, установ­ ленная с помощью модификации ее диметилсульфатом и водорастворимым карбодиимидом.

uи с С

Рис. 39. Вторичная структура одного из доменов 28S РНК мыши. Участки, моди­ фицируемые диметилсульфатом и водорастворимым карбодиимидом, отмечены со­ ответственно буквами D и С

В качестве еще одного примера представлены двунитевые и расплетен­ ные участки ДНК и находящиеся в комплексе с последней молекулы РНК (косые символы), полученные при транскрипции 11 и 20 нуклеотидов (рис. 40).

Транскрипция инициировалась с помощью рибонуклеотида pAUC, ком­ плементарного первым трем нуклеотидам транскрибируемого фрагмента, считая от 3’-конца матрицы. На протяжении 8 нуклеотидных остатков от конца праймера на транскрибируемой нити находятся только пиримидино­ вые нуклеотиды. Поэтому при использовании в качестве субстратов транс­ крипции только GTP и АТР процесс останавливается после включения 11-го нуклеотида из-за отсутствия СТР. Выделение остановленного транскрипци­ онного комплекса и продолжение элонгации в присутствии СТР и АТР по­ зволяет удлинить транскрипт еще на три нуклеотида. В новом выделенном комплексе с транскриптом длиной 14 нуклеотидов может быть осуществлена

элонгация до получения 20-звенного транскрипта с использованием в качест­ ве субстратов СТР, АТР и GTP. Положение развернутого участка ДНК (взду­ тия) определялось с использованием трех реагентов, специфичных каждый к одному типу гетероциклов: ОвОд к тимину; диэтилпирокарбоната к аденину; диметилсульфата с последующей обработкой гидразином к цитозину. Схема найденного таким образом вздутия для фрагментов ДНК после обра­ зования транскриптов длиной 11 и 20 нуклеотидов, приведена на рис. 40.

TGTGCCGCTTAT

II I II II I I

CACGGCGAA

AUCGAGAGGGA

Рис. 40. Структура расплетенного фрагмента ДНК (прямые символы) и находя­ щейся с ним в комплексе молекулы РНК (косые символы), полученные при транс­ крипции 11 (а) и 20 (б) нуклеотидов. РНК-полимераза, присутствующая в комплексе, не изображена. Подчеркнуты и выделены жирным шрифтом участки ДНК, находя­ щиеся в контакте с РНК-полимеразой по данным футпринтинга ОН-радикалами (§ 12.4). Вертикальными черточками обозначены водородные связи между компле­ ментарными гетероциклами

Реакционная способность остатков нуклеотидов в ДНК и РНК, в первую очередь остатков гетероциклов, существенно изменяется - как правило, уменьшается при их участии в образовании комплексов с белками и другими соединениями. Поэтому химическая модификация широко используется для выявления фрагментов нуклеиновой кислоты, участвующих в комплексообразовании. Этот вопрос рассматривается в § 12.4.