КНОРРЕ_3227

лективности по остаткам цитозина, почти не затрагивая остатки тимина. Это позволяет получать производное, в котором на месте всех остатков цитозина находится апиримидиновый сайт. В общем случае фрагменты ДНК, лишен­ ные гетероциклического основания, называют апуриновыми/апиримидиновыми сайтами, или сокращенно АП-сайтами.

Избыточный положительный заряд на атоме С4 цитозина способствует замещению аминогруппы на различные нуклеофилы - амины (реакция переаминирования) и на анион ОН" (дезаминирование). Так, в частности, можно заместить С4 аминогруппу цитозина на радикал -NH(CH2)„NH2.

NH2(CH2)nNH2

Таким образом, можно ввести в положение С4 цитозина алифатическую аминогруппу, которая может быть проацилирована производными, несущими различные функциональные группы - реакционноспособные, флуоресци­ рующие и т. п. Реакции с аминами требуют участия последних в непротонированной форме, чему благоприятствуют щелочные условия. Эти же условия приводят к увеличению дезаминирования цитозина. Следовательно, при вве­ дении радикалов, содержащих алифатическую аминогруппу, дезаминирова­ ние и переаминирование являются конкурентными процессами. В первом случае происходит превращение цитозина в урацил. При переаминировании образуются различные производные по остатку цитозина. Эти реакции осо­ бенно эффективно протекают, если по атому С6 введен остаток сульфита, который по окончании реакции может быть удален в щелочной среде. Суще­ ственно, что при переаминировании один атом Н при азоте N4 сохраняется, и тем самым сохраняется способность к Уотсон-Криковскому взаимодейст­ вию с комплементарным остатком G. Поэтому такие модифицированные ос­ татки цитозина могут служить компонентами двунитевой структуры нуклеи­ новой кислоты, а соответствующие нуклеозидтрифосфаты - субстратами при репликации и транскрипции. Замещение аминогруппы может быть особенно мягко проведено, если заменить 4-аминогруппу на остаток 1,2,4-триазола, связанного с атомом Ы4-цитозина по атому N4 триазола.

52_______ Гчава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот

рис. 12 приведена схема реакции с остатком урацила в качестве донора про­ тона. В этом случае на имеющем кислый характер атоме N3 возникает отри­ цательный заряд, и по этому атому происходит метилирование. Аналогично проходит алкилирование по атому N3 остатка гуанина. В водных условиях донором Н* становятся молекулы воды, и точками алкилирования становятся атомы пиридинового типа, например, N3 цитозина и N7 гуанина.

С Н , +

сн,

h2n'

CH2N2; Н20

Рис. 12. Схема метилирования гетероциклов диазометаном

При реакции с пероксидами (смесь Н2О2 с кислотой или надкислоты) ато­ мы N пиридинового типа могут превращаться в N-оксиды.

2.2.6. Реакции по NH-C=0 группам

В гетероциклы уридина, тимидина, гуанозина и некоторых минорных компонентов (инозин, псевдоуридин) входят атомы азота в виде -NH-CO- групп. Такие атомы азота в силу сопряжения с С=0 группой не обладают ос­ новными свойствами. Однако в слабощелочной среде группа N-H ионизуется с образованием нуклеофильного аниона, который может реагировать с электрофильным атомом С карбодиимидов с образованием продукта присоедине­ ния карбодиимида по этому атому N.

Реакция проходит по атомам, которые при образовании дуплексных структур не участвуют в Уотсон-Криковских взаимодействиях, поэтому при­ веденная реакция не проходит по остаткам гуанина и урацила в двуспираль­ ных фрагментах нуклеиновых кислот, что делает ее полезной для выявления таких фрагментов в нуклеиновых кислотах. Реакция с UMP проходит в не­ сколько раз быстрее, чем с GMP. С наибольшей скоростью реакция проходит по остаткам инозина и псевдоуридина.

2.2.7. Окисление по двойной связи С5=С6

По связи С5=С6 пиримидиновых оснований могут проходить различные реакции окисления с образованием 5,6,-дигидроксипиримидиновых основа­ ний. Такие производные, в частности, получаются при окислении КМпС>4, однако подобные основания неустойчивы, и происходит деградация гетеро­ цикла. Достаточно устойчивы дигидроксипроизводные, получаемые при ис­ пользовании в качестве окислителя тетроксида осмия. Первой стадией реак­ ции является циклоприсоединение 0 s0 4 с последующим гидролизом, приво­ дящим к отщеплению OsC>2(ОН)г-

HN OsO.

«А Н

2.2.8. Реакции по экзоциклическим аминогруппам

Среди реакций по экзоциклическим аминогруппам в первую очередь сле­ дует отметить реакции ацширования, используемые для введения защит в целях последующего использования N-ацилнуклеозидов в качестве моно­ меров в химическом синтезе олигонуклеотидов (гл. 5). Ацилирование прово­ дится с помощью соответствующих хлорангидридов в пиридине.

Вторая важная реакция по экзоциклическим аминогруппам - дезаминиро­ вание под действием азотистой кислоты. Оно происходит через промежуточ­ ное образование диазония, который легко гидролизуется с образованием ОН-

альдегидной группы с экзоциклической аминогруппой. В результате проис­ ходит формирование пятичленного гетероцикла.

2.2.10. Фотохимические реакции пиримидиновых гетероциклов

Широкое применение нашли фотохимические реакции присоединения по двойной связи СН=СН. Детально изучена реакция циклодимеризации тиминов, происходящая между соседними остатками тимидина в составе ДНК и являющаяся одним из главных источников повреждения ДНК ультрафиоле­ товым светом. В результате реакции может образоваться четыре изомера

(рис. 13).

Рис. 13. Структура изомерных продуктов фотохимической циклодимеризации ос­ татков тимина

Если на комплементарных цепях в благоприятном взаимном расположе­ нии находятся два остатка тимина, то легко проходит циклоприсоединение в составе ДНК к псоралену и его производным. Особенностью этого реагента является его бифункциональность - фотохимическая реакция может проис­ ходить как по пироновому, так и по фурановому циклу псоралена. При этом циклоприсоединение по фурановому циклу не лишает способности произ­ водного псоралена участвовать в циклоприсоединении к тимину по пироно­ вому циклу. Наибольшее применение нашел 4,5’,8-триметилпсорален. На рис. 14 представлена схема последовательного взаимодействия этого произ­ водного с двумя остатками тимина.

Среди многочисленных производных нуклеозидов и нуклеотидов широ­ кое применение нашли производные, несущие фотоактивные группы. Они могут быть легко введены в исходные производные, если в них предвари­ тельно введена алифатическая аминогруппа, которая затем может быть проацилирована N-гидроксисукцинимидными эфирами фотоактивных производ­ ных. Аминогруппа может быть введена в положения 4 или 5. При связывании фотоактивной группы с атомом С5 остатка урацила реакция проходит по атому, который не участвует в Уотсон-Криковских взаимодействиях.

2.2.11. Реакции гетероциклических оснований со свободными радикалами

Рассмотренные превращения являются гетеролитическими и характери­ зуются высокой специфичностью. В отличие от них гомолитические превра­ щения оснований, происходящие при действии на них свободных радикалов, значительно менее специфичны и, следовательно, многообразны. Эти пре­ вращения особенно интенсивно изучались в связи с исследованием механиз­ ма воздействия проникающей радиации. Главным источником свободных радикалов в биологических системах при радиолизе является образование из воды свободных гидроксилов ЮН. Для радикалов ЮН характерны реакции отрыва атомов Н и реакции присоединения по двойной связи. Ниже приво­ дятся эти реакции по остаткам тимина.

о

•он

R

Аналогично проходят реакции по гетероциклам в случае урацила и цитозина. Образовавшиеся свободные радикалы либо рекомбинируют друг с другом с образованием соответствующих димеров, либо при наличии в среде окис­

лителя (донора электронов) превращаются в высокореакционноспособный карбокатион. Последний, в частности, может реагировать с водой с образова­ нием соответствующих дигидроксипроизводных. Ниже эти превращения представлены для тимина в случае, если ОН-радикал присоединился к атому Сб.

Образующиеся дигидроксипроизводные могут претерпевать последую­ щую окислительную деградацию. Так, остаток 5,6-дигидрокситимина может превращаться в остаток 'И-формил-^-пирувилмочевины и далее в остаток N-формилмочевины и затем мочевины.

I

R

Г

,n h 2

o=c(

NHR

Если процесс происходит в присутствии кислорода, то в первую очередь присоединяется молекула Ог с образованием пероксирадикала, который мо­ жет претерпевать разнообразные превращения, в частности, образование не­ устойчивого тетроксида. Последний может далее превращаться несколькими путями с регенерацией Ог, образованием Н2О2 или радикалов ЮН. В ряде случаев эти реакции сопровождаются расщеплением гетероцикла.

§ 2.3. Реакции по углеводным остаткам

ОН-группы углеводных фрагментов являются реакционноспособными группами. У свободных дезоксирибонуклеозидов таких групп две, а у рибонуклеозидов - три. В последнем случае две ОН-группы находятся в цисположении относительно друг друга (т. е. являются соседними), в связи с чем часто этот фрагмент называют цис-диольной группой. В нуклеотидах некото­ рые из ОН-групп соединены с остатком фосфорной кислоты. Если в состав нуклеотида входит один такой остаток, то в нуклеотиде остается одна (дезоксинуклеотиды) или две (рибонуклеотиды) свободных ОН-группы. В последнем случае если фосфат присоединен к 5’-ОН-группе, то в нуклео­ тиде сохраняется цис-диольный фрагмент. В полинуклеотидах, за исключе­ нием концевой группы в случае ДНК, ОН-группа сохраняется в единствен­ ном числе на нефосфорилированном конце. В РНК ОН-группа присутствует

в каждом мономерном звене, а если на ее 3’-конце остатки фосфорной кисло­ ты отсутствуют, то на этом конце сохраняется цис-диольный фрагмент.

Широкое применение нашли реакции по цис-диолъной группе, которая легко окисляется перйодатом с разрывом С-С связи и образованием диальдегидного производного. По альдегидным группам могут быть проведены раз­ личные превращения, например, реакции с аминами. При этом образуются легко гидролизуемые основания Шиффа, однако они могут быть стабилизи­ рованы обработкой боргидридом натрия с превращением оснований Шиффа в амины. На рис. 15 в качестве примера приведены соответствующие пре­ вращения АТР.

NaBH

СН2 СН2

NHR NHR

Рис. 15. Превращения рибозного фрагмента в АТР

Такие же превращения могут происходить с 3’-концевыми цисдиольными группами олигорибонуклеотидов и молекул РНК.

По ОН-группам в водном растворе может быть проведено ацилирование. Поэтому обработкой уксусным ангидридом можно получить полимерную молекулу РНК, ацетилированную по ОН-группе каждого звена. Наличие ОНгрупп в углеводном фрагменте создает определенные затруднения при введе­ нии ацильных защит по экзоциклическим аминогруппам, поскольку оно со­ провождается ацилированием ОН-групп пентозного фрагмента. Однако это затруднение легко преодолевается, поскольку сложноэфирные связи можно гидролизовать в щелочной среде в условиях, не затрагивающих ациламидные связи. Более мягкой процедурой является предварительная обработка нуклеозида триметилхлорсиланом, приводящая к введению по ОН-группам (CH3)3Si-ocTaTKa. После ацилирования аминогрупп гетероциклов триметилсилильные группы легко удаляются мягкой щелочной обработкой.

Пентозные фрагменты могут реагировать со свободными радикалами, в частности с *ОН, образующимися при радиолизе. Взаимодействие пред­ ставляет собой отрыв атомов Н. Реакционная способность радикалов ЮН по отношению к С-Н-связям остатков пентоз в несколько раз ниже, чем по от­