КНОРРЕ_3227

нг0 | R'OY y В _ к' ° > ° у В _

ОН

R'O

R

H20

-R’0H ,-H C 02H

R"0 R"0

Рис. 16. Окончание

Образовавшиеся свободные радикалы претерпевают различные превра­ щения в зависимости от положения атома Н и наличия или отсутствия ки­ слорода. В некоторых случаях у полинуклеотидов процесс сопровождается разрывом межнуклеотидных связей.

§ 2.4. Реакции по остаткам фосфорной кислоты

Большое число задач биоорганической химии требует проведения реак­ ций по фосфоэфирным связям и остаткам фосфорной кислоты. Среди них можно выделить три основные группы. Во-первых, в ряде случаев представ­ ляют интерес различные производные и аналоги нуклеотидов и нуклеиновых кислот по остаткам фосфорной кислоты. Во-вторых, реакции по остаткам фосфорной кислоты являются неотъемлемым элементом при образовании новых межнуклеотидных связей при химическом синтезе олигонуклеотидов

инуклеиновых кислот. Эти реакции будут рассмотрены в главе 5, посвящен­ ной химическому синтезу олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот. В-третьих, существует широкий спектр задач, требующих расщепления фосфодиэфирных связей. Этот вопрос будет рассмотрен в следующем разделе данной главы.

Разнообразные применения находят фосфамидные производные моно-

иолигонуклеотидов. Число способов получения фосфамидов довольно вели­ ко, и здесь будут изложены лишь отдельные наиболее широко используемые подходы. Фактически все они основаны на превращении остатка фосфорной кислоты в реакционноспособное производное, которое реагирует с амином с уменьшением свободной энергии. Такое превращение, как правило, квали-

фицируют как активацию фосфатного остатка. Один из первых успешных методов основан на активации фосфатного остатка дифенилфосфохлоридом. При этом образуется тризамещенный пирофосфат:

В соответствии с известной для смешанных ангидридов закономерно­ стью, согласно которой реакции проходят так, чтобы уходящей группой был анион более сильной кислоты, образовавшиеся пирофосфаты при реакции с нуклеофилами дают производные монозамещенного фосфата.

Образование фосфамида в этом случае сопровождается превращением связи Р-Cl дифенилфосфохлорида в фосфоангидридную связь тризамещенного пирофосфата, которое и обуславливает сопряжение двух процессов.

Значительное число работ по фосфорилированию выполнено с использо­ ванием соответствующих фосфоимидазолидов, у которых остаток имидазола способен протонироваться в слабокислой среде, что существенно повышает электрофильность атома Р. Наиболее удобным способом введения остатка имидазола по фосфорильной группе является применение для этой цели карбодиимидов. Механизм их действия будет детально рассмотрен в § 10.3.

Удобным для образования фосфамидов оказалось использование для ак­ тивации фосфата реакции последнего с хлорангидридом 2,4,6-триметил- бензойной кислоты (мезитоилхлоридом MsCl). В случае олигодезоксирибонуклеотида в реакцию с MsCl вступают не только концевая фосфатная груп­ па, но и межнуклеотидные фосфаты, однако образуемые ими смешанные ан­ гидриды неустойчивы в воде и практически мгновенно гидролизуются, по­ этому при действии на образовавшийся продукт аминов получаются амиды только по концевому фосфату.

Но при действии того же мезитоилхлорида на олигорибонуклеотиды об­ разующиеся смешанные ангидриды по межнуклеотидным фосфатам могут атаковать близко расположенную 2’-ОН-группу с образованием циклофос­ фатной группы. Последняя при действии воды может дальше гидролизовать­ ся по любой из трех фосфоэфирных связей (рис. 17).

Гидролиз по связям, формирующим циклическую структуру, приводит либо к регенерации исходной 3’-5’-фосфодиэфирной связи, либо к образова­

Рис. 18. Окислительно-восстановительное фосфорилирование по Мукаяма. Nu - нуклеофил

Использование этой системы позволило получать эффективные фосфорилирующие производные, в которых с атомом Р связаны остаток N-метил- имидазола (а), 1^,М-диметиламинопиридина (б) или N-окси-и-диметил- аминопиридина (в):

Несмотря на высокую фосфорилирующую активность, соответствующие производные олигонуклеотидов достаточно устойчивы в водных растворах и могут использоваться в качестве реагентов для фосфорилирования в водной среде.

Важной особенностью этого метода активации фосфата является неспо­ собность в присутствии сильных аминов реагировать со вторичными фосфа­ тами, т. е. возможность получать монозамещенную концевую фосфатную группу в присутствии таких аминов. Это, в частности, открывает возмож­ ность получать производные по концевому остатку фосфорной кислоты в случае рибоолигонуклеотидов. В отсутствие сильных аминов, по-видимому, может происходить фосфорилирование межнуклеотидных фосфатов олигорибонуклеотидов, что неизбежно будет сопровождаться теми же побочными

процессами, которые уже были рассмотрены выше на примере реакций олигорибонуклеотидов с хлорангидридом мезитиленкарбоновой кислоты.

Относительно недавно В. С. Богачевым был предложен эффективный ме­ тод активации концевого фосфата с помощью трифторуксусного ангидрида. В реакции с тимидинмонофосфатом образуется смешанный ангидрид между остатком фосфорной кислоты и трифторацетильным остатком

P-Thd +(CF3C0)20 -> CF3COOP-Thd,

который легко реагирует с нуклеофильными агентами. В настоящее время наиболее широкое использование нашла реакция этого смешанного ангид­ рида с неорганическим пирофосфатом, приводящая к образованию нуклео- зид-5 ’-трифосфата.

§ 2.5. Расщепление фосфодиэфирных связей в нуклеиновых кислотах

Для расщепления полинуклеотидных цепей используются как фермента­ тивные, так и химические методы.

Ферменты, катализирующие гидролиз межнуклеотидных связей, называ­ ются нуклеазами. Если они катализируют гидролиз связей внутри полинуклеотидной цепи, то их называют эндонуклеазами. Ферменты, катализирую­ щие отщепление концевых мононуклеотидов, называют экзонуклеазами. Эн­ донуклеазы, способные гидролизовать межнуклеотидные связи только в полидезоксирибоолигонуклеотидах, называются ДНКазами. Среди них наибо­ лее детально изучена панкреатическая дезоксирибонуклеаза {ДНКаза), выде­ ляемая из поджелудочной железы. Она катализирует разрыв связей с образо­ ванием З’-ОН-группы на одном из образовавшихся фрагментов и 5’-фосфата на другом.

Широко представлены в природе эндонуклеазы, специфичные к РНК (РНКазы). Для РНКаз характерна специфичность к природе оснований у нук­ леотида при расщепляемой связи. Например, наиболее детально изученная панкреатическая РНКаза специфично расщепляет З’-ОН-связи, образуемые пиримидиновыми нуклеотидами.

Экзонуклеазы обычно способны отщеплять мононуклеотиды как от поли- рибо-, так и полидезоксирибонуклеотидов. Среди этих экзонуклеаз широко используется фосфодиэстераза змеиного яда, катализирующая отщепление 5’-нуклеотидов с З’-конца цепи, и фосфодиэстераза селезенки, катализи­ рующая отщепление 3’-нуклеотидов от 5’-конца.

Перечисленные ферментативные методы неспецифичны к нуклеотидной последовательности в области расщепляемой связи. Наряду с этим были об­ наружены и нашли широкое применение ферменты, катализирующие специ­ фическое расщепление ДНК при определенных нуклеотидных последова­ тельностях и получившие название эндонуклеаз рестрикции. В связи с ог­

ромной ролью, которую сыграли эти ферменты при решении проблемы секвенирования ДНК, они будут рассмотрены в гл. 4, посвященной установле­ нию первичной структуры нуклеиновых кислот.

Межнуклеотидные связи в полидезоксирибонуклеотидах довольно проч­ ны, и химические реакции, непосредственно приводящие к их разрушению, сопровождаются превращениями нуклеозидного фрагмента, в первую оче­ редь расщеплением гликозидных связей. В то же время возможно селектив­ ное расщепление этих связей по точкам, содержащим АП-сайты. Такие сайты могут также образовываться при действии специальных ферментов, гликозидаз, катализирующих гидролиз гликозидных связей и играющих важную роль при ликвидации повреждений в ДНК (ферменты репарации). В § 2.2 показа­ но, что такие сайты образуются при протонировании пуриновых нуклеоти­ дов, при их алкилировании и при действии гидразина на пиримидиновые нуклеотиды. Схема расщепления полидезоксирибонуклеотидной цепи по АПсайтам приведена на рис. 19.

+

+ В'-Н

+

+ В'-Н

Рис. 19. Схема расщепления полидезоксирибонуклеотидной цепи по АП-сайту

В отличие от ДНК, непосредственное химическое расщепление РНК и полирибонуклеотидов происходит в достаточно мягких щелочных условиях в результате внутримолекулярного фосфорилирования 2’-ОН-группы с обра­ зованием циклического 2’,3’-фосфата на 3’-конце. Аналогичное расщепление может происходить и при некоторых других химических воздействиях на фосфодиэфирную связь в полирибонуклеотидах. Интересные приложения нашло расщепление межрибонуклеотидных связей алкилированием N-нитро- зоалкилмочевиной. Реакция идет, по-видимому, через промежуточное обра­ зование диазопроизводного, которое, как описано в § 2.2 для диазометана, является алкилирующим реагентом (рис. 20).

Основными точками апкилирования являются межнуклеотидные фосфа­ ты. Это приводит к образованию соответствующих фосфотриэфиров. По­ следние существенно менее устойчивы к действию щелочей, чем фосфодиэфиры, и при обработке их щелочью происходит гидролиз по одной из связей P-О. Частично это приводит к регенерации фосфодиэфирной группы, а час­ тично - к расщеплению в этой точке межнуклеотидной связи, как показано на приведенной схеме рис. 20.

1

RO— Р— OR' +ХОН

II

О

ХН = СН3(С2Н5)

R и R' - фрагменты РНК по разные стороны от точки алкилирования

Рис. 20. Расщепление межнуклеотидных связей алкилированием

Расщепление по межнуклеотидным связям необходимо при решении ши­ рокого спектра задач. Использование эндо- и экзонуклеаз является основным промышленным методом получения мономеров - нуклеотидов и нуклеозидов из природных нуклеиновых кислот. Получение их путем органического син­ теза, в принципе возможного, было бы громоздким многостадийным процес­ сом. Расщепление нуклеиновых кислот по определенным точкам специфич­ ными нуклеазами является необходимым этапом в разнообразных исследова­ ниях нуклеиновых кислот, в частности, при некоторых методах установления первичной структуры нуклеиновых кислот.

Глава 3. Первичная структура нуклеиновых кислот

§ 3.1. Общие принципы установления первичной структуры биополимеров

Нуклеиновые кислоты и белки являются нерегулярными линейными по­ лимерами, построенными в случае нуклеиновых кислот из четырех, а в слу­ чае белков - из 21 типа мономеров, причем порядок чередования мономеров в цепи существенно определяет биологическую значимость полимера. По­ этому установление первичной структуры (секвенирование от англ. sequence - последовательность) биополимеров является одной из важнейших задач биоорганической химии биополимеров. Очевидно, что идеальный вариант уста­ новления первичной структуры состоял бы в последовательном отщеплении от одного из концов полимера по одному остатку мономера с идентификаци­ ей каждого отщепленного остатка. Подходы к такому определению последо­ вательности нуклеотидов в ДНК находятся в стадии интенсивной разработки. Предполагается, что закрепленная на определенном носителе молекула нук­ леиновой кислоты подвергается действию экзонуклеазы, а каждый последо­ вательно отщепляемый нуклеотид идентифицируется по спектру, поскольку спектры различных мономеров различаются. Как правило, для идентифика­ ции планируется использование спектров флуоресценции, что обеспечивает наиболее высокую чувствительность.

Едва ли среди проблем, стоявших перед биоорганической химией, можно назвать такую, которая по скорости и масштабам взлета могла бы быть соиз­ мерима с проблемой установления первичной структуры нуклеиновых ки­ слот. Действительно, крупным успехом середины 60-х годов было установ­ ление первичных структур нескольких транспортных РНК размером менее сотни нуклеотидов. А в 2003 году успешно завершилось установление первой полной структуры генома человека. Это было достигнуто работой большой группы ученых, и стоимость работы составила один миллиард долларов. В настоящее время уже активно разворачивается работа по созданию мето­ дов, которые дали бы возможность устанавливать структуру генома опреде­ ленного человека за считанные недели с затратами в несколько тысяч долла­ ров. Фактически речь идет о возможности получения «геномного паспорта» для любого индивидуума.

Поскольку представленный выше идеальный вариант определения пер­ вичной структуры пока еще отсутствует, неизбежным этапом определения первичной структуры биополимеров является их расщепление на фрагменты, которые могут быть секвенированы доступными на сегодня методами. Вто­ рым этапом является само секвенирование каждого из полученных фрагмен-