КНОРРЕ_3227

220Гпава 10. Химический синтез пептидов и белков

Взависимости от относительной реакционной способности а-амино- группы аминокислоты и защищаемой боковой группы защита последней по вводится либо в исходную, либо в N-защищенную аминокислоту.

Для защиты карбоксильных боковых радикалов аспарагиновой и глута­ миновой кислот наибольшее применение нашли гире/и-бутиловые и бензиловые эфиры. Простые алкиловые эфиры с боковыми карбоксильными группа­ ми для защиты боковых СООН-групп не используют, поскольку при их де­ блокировании на заключительной стадии синтеза возможна изомеризация пептидной связи, образованной а-карбоксильной группой остатка дикарбоновой аминокислоты, с образованием амидной связи с боковой карбоксиль­ ной группой.

трет-Бутиловые эфиры можно получать с высоким выходом при взаи­ модействии защищенных аминокислот и ди-треот-бутилпирокарбоната.

Синтез бензиловых эфиров проводят путем нагревания суспензии а-аминокислот в бензоле или четыреххлористом углероде с бензиловым спиртом в присутствии сульфокислоты, осуществляя одновременно азеотропную отгонку образующейся в процессе реакции воды. В ряде случаев этерификацию проводят путем обработки в присутствии основания бензилбромидом производных аминокислот, защищенных по всем группам, кроме карбоксильных.

222 Глава 10. Химический синтез пептидов и белков

■н

сн,

I 3

н3с- с=сн,

Для удаления бензильного остатка наиболее приемлемым является ката­ литическое гидрирование над Pd/C.

При защите 8-аминогруппы лизина с помощью какого-либо электрофильного реагента необходимо избежать его реакции с а-аминогруппой. Это мо­ жет быть достигнуто путем формирования комплекса с ионами двухвалент­ ной меди. Такому процессу способствует благоприятное взаимное располо­ жение а-амино- и карбоксильной групп:

Участие неподеленных пар электронов а-аминогрупп в образовании ко­ ординационной связи резко снижает их нуклеофильность, что позволяет из­ бирательно ввести защитную группу, например, бензилоксикарбонильную, по s-аминогруппе лизина. После введения защиты комплекс с ионами меди разрушают путем добавления хелатирующего соединения, например, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты).

§ 10.7. Блокирование боковых групп в аминокислотах__________ 223

При некоторых методах создания пептидной связи необходима защита гидроксильных групп в тирозине, серине и треонине. Это достигается введе­ нием бензшьной (Bzl) или трет-бутшьной защиты с помощью соответст­ вующих алкилирующих реагентов. Одновременно с реакцией по ОН-группе аминокислоты в обычных условиях происходит алкилирование карбоксиль­ ной группы этих аминокислот с образованием соответствующих сложных эфиров. Последние могут быть удалены щелочным омылением, при котором простые эфиры, образованные ОН-группами, не разрушаются.

Реакции алкилирующих реагентов с карбоксильными группами можно избежать, если при алкилировании использовать медные комплексы соответ­ ствующих аминокислот. Так, процессы, приводящие к получению О-бензил- тирозина, описываются следующей схемой:

с—сн

// \ /=ч

ОCH2-^ /-0 -C H 2-Ph

О-трет-бутиповые эфиры гидроксиаминокислот образуются с хорошим выходом при обработке свободных аминокислот или их метиловых эфиров изобутиленом в присутствии кислоты (H2SO4, TosOH, BF3-Et20).

СН,

Удаление этой защитной группы в синтезированных пептидах проводится мягкой кислотной обработкой. Условия удаления O-wpe/и-бутильной группы: HBr/CF3COOH 30 мин, CF3COOH - 6 ч.

Удаление Обензильной группы остатков О-бензил-тирозина в синтезиро­ ванных пептидах может быть проведено обработкой сильными кислотами (например, жидкий HF). Однако в этих условиях иногда происходят пере­ группировки в ароматическом кольце.

v^-NH-CH-CO^A v~NH-CH-CO-^/

Для уменьшения степени протекания этого процесса при обработке пеп­ тидов жидким HF обычно используют защитные добавки (анизол, тиоанизол), которые играют роль своеобразных ловушек для реакционноспособных катионов.

Некоторые защитные группы для тирозина, например, 2,6- дихлорбензшьная [(2,6)C1-Bzl], отличаются существенно меньшей способно­ стью алкилировать кольцо Туг в условиях деблокирования. Эта группа вво­ дится путем обработки медного комплекса тирозина 0-2,6- дихлорбензилбромидом. После завершения синтеза пептидной цепи защит­ ная группа гладко удаляется безводным фтористым водородом в течение 1 ч при 0 °С.

Гуанидиновая группа аргинина является сильно основной (рКг ~ 12,5) и поэтому остается протонированной на всех стадиях обычного пептидного синтеза, что фактически эквивалентно ее защите. В связи с этим в ряде слу­ чаев не требуется дополнительная защита, и описано немало синтезов, при которых гуанидиновая группа аргинина оставалась немодифицированной. Отсутствие защиты особенно полезно на завершающих стадиях синтеза, ко­ гда протонирование гуанидиновой группировки обеспечивает достаточную растворимость вещества в полярной среде.

Если вводится защита по гуанидиновой группе, то, как правило, ограни­ чиваются реакцией по одному (обычно со), иногда двум (8 и со) атомам N гуа­ нидинового фрагмента. Наиболее широко используемыми защитами являют­ ся нитро-, бензилкарбокси-, и-толуолсульфонильная и адамантилкарбокси(Лс/ос)-группы.

оо’-Нитро-Ь-аргинин легко получить из свободной аминокислоты дейст­ вием смеси олеума и азотной кислоты. Лучшие результаты получаются при нитровании аргинина нитратом аммония в серной кислоте.

После завершения синтеза пептида защиту можно удалить каталитиче­ ским гидрированием над палладием. Гидрирование над палладиевой чернью продолжается обычно 12-30 ч; иногда для этого требуется повышенная тем­ пература. Поэтому для удаления нитрогруппы более удобны методы восста­ новления без применения водорода. Например, при обработке нитроаргинина муравьиной кислотой или формиатом аммония в присутствии палладия за­ щитная группа отщепляется в первом случае за 5 ч, а во втором - за 10 мин. Нитрогруппу можно удалить циклогексеном в присутствии палладиевой чер­ ни. В случае проведения синтеза пептида твердофазным методом (§ 10.9) нитрогуанидиновая группа деблокируется безводным фтористым водородом.

Введение нитрогруппы приводит к понижению основности гуанидиновой функции. Однако нуклеофильность гуанидиновой группы подавляется не в полной мере, и поэтому в процессе активации карбоксильной группы в за­ щищенном по а-аминогруппе аргинине может наблюдаться образование 8-лактама. Это преобладающая побочная реакция при таком типе защиты.

Применение бензилоксикарбонильной группы позволяет одновременно ввести защиту как по боковой гуанидиновой, так и по концевой а-амино- группе. Для получения Л^Л^А^^з-аргинина лучшим является метод, осно­ ванный на предварительном триметилсилилировании аргинина с последую­ щим его бензилоксикарбонилированием. Реакция завершается в течение 60 ч при температуре 60 °С и проходит с выходом конечного продукта реакции порядка 50 %. Защиту можно удалить каталитическим гидрированием.

Очень устойчивые Л^-толуол-я-сульфонилпроизводные аргинина находят все возрастающее применение особенно в твердофазном синтезе пептидов. Эти производные получают обработкой Z-Arg или Boc-Arg в течение 2 ч при 0 °С и-толуолсульфохлоридом в сильнощелочной водно-органической среде.

и-Толуолсульфонильная группа может быть удалена только при действии очень сильной кислоты (жидкого фтористого водорода) или путем восста­ новления натрием в жидком аммиаке.

В случае использования Fmoc-Axg{Tos) протекание побочной реакции об­ разования 8-лактама может быть существенно подавлено, если проводить синтез карбодиимидным методом в присутствии iV-гидроксибензотриазола.

ЛйЬс-группу (адамантилоксикарбоншьную) можно ввести, добавляя к ^-защищенной аминокислоте (например, Z-Arg) при 6-8 °С раствор све­ жеприготовленного 1-хлорформилоксиадамантана. Общее время реакции 4 ч.

Adoc-трутты сохраняются при удалении N-концевой бензилкарбоксигруппы путем гидрогенолиза и удаляются в кислых условиях. Образование &лактама минимально при использовании в пептидном синтезе w-нитро-

фениловых эфиров Na-Fmoc-N6,NC0-ATg(Adoc)2-OC(>HlibiO2 .

Adoc-группы удаляются в кислых условиях. Побочной реакцией, наблю­ даемой в этой серии превращений, является атака свободной а-аминогруппы на диацилированную гуанидиновую функцию. Этот процесс, вероятно, ката­ лизируется слабыми кислотами.

Adoc

Необходимость защиты остатков гистидина в пептидном синтезе обу­ словлена в первую очередь двумя свойствами остатков имидазола. Вопервых, имидазол и его производные с незащищенным гетероциклом явля­ ются эффективными катализаторами расщепления амидных и сложноэфир­ ных групп. В особенности это свойство может проявляться при соответст­ вующем наборе аминокислотных остатков в синтезируемом пептиде, когда гистидин может формировать системы «с переносом заряда» по типу геомет­ рически близко расположенных аминокислотных остатков триады Asp-His- Ser в активном центре сериновых протеаз (§ 16.2).

Во-вторых, незащищенный имидазольный гетероцикл может подвергать­ ся ацилированию активированными карбоксильными компонентами, причем получающиеся ацильные производные сами по себе достаточно реакционно­ способны и могут затем вызывать перенос ацильной группировки в разные участки молекулы. По этой же причине Л^'-ацильные производные гистидина часто неудобны в качестве синтетических интермедиатов, если на ряде ста­ дий нужно сохранить находящуюся в боковом радикале защиту.

Кроме того, отмечено, что гистидиновые производные с незащищенным имидазольным циклом особенно склонны к рацемизации в процессе пептид­ ного синтеза (§ 10.10), по-видимому, по реакции: