КНОРРЕ_3227

Проведенный к настоящему времени рентгеноструктурный анализ сотен белков показал наличие у многих из них а-спиральных фрагментов. Естест­ венно, что идеальная а-спираль в белках не реализуется, поскольку на пара­ метры спирали в разной степени оказывают влияние боковые радикалы ами­ нокислотных остатков. В идеальной спирали угол <р должен составлять -57°, а угол vj/ -47°. Расстояние до оси спирали должно быть для атомов N 0,15 нм, для атомов Са- 0,23 нм, для атомов С’ - 0,17 нм.

В табл. 12 в качестве иллюстрации приведены найденные из рентгеност­ руктурных данных параметры для а-спирального фрагмента фосфоглицераткиназы, фермента, катализирующего реакцию

0 3Р-СН2-СН0Н-С00' + АТР -> 0 3Р-СН2-СН0Н-С00Р0з' + ADP

Эта реакция является одной из стадий цикла Кальвина, в результате кото­ рого при фотосинтезе происходит фиксация СОг молекулой рибулозо- 1,5- дифосфата, приводящая через ряд промежуточных реакций к синтезу фрук- тозо-6-фосфата.

Из приведенных в таблице данных видно, что все основные геометриче­ ские параметры не одинаковы, но в пределах а-спирального фрагмента они не сильно отличаются от величин, рассчитанных для идеальной спирали. В то же время те же параметры для примыкающих участков могут резко отли­ чаться от идеальных величин. Эти отличия видны лишь по значениям торси­ онных углов, поскольку величины расстояний до оси не имеют смысла, так как при отсутствии спиральной конформации отсутствует и сама ось.

Таблица 12 Геометрические параметры а-спирального фрагмента полипептидной цепи

фосфоглицераткиназы

Видеализированной Р-складке торсионные углы должны иметь значения

ф= -119° и vj/ = +113°. Как и в случае а-спирали, реальные значения этих уг­ лов несколько отличаются от идеальных из-за влияния боковых радикалов. В качестве примера в табл. 13 представлены данные для фрагмента 282-286 полипептидной цепи фосфоглицераткиназы. Для сравнения даны также па­ раметры для атомов, примыкающих к структурированному фрагменту.

Из приведенных в таблице данных видно, что в образовании Р-складки участвует пептид Asp-Phe-Ile-Ile-Ala.

Какую конформацию примет тот или иной участок полипептидной цепи зависит от его первичной структуры. Но существенное влияние могут оказы­ вать и другие участки белковой молекулы, так что задача установления вто­ ричной структуры по первичной до сих пор не имеет однозначного решения.

Таблица 13 Некоторые геометрические параметры Р-складки фрагмента полипептидной цепи

фосфоглицераткиназы

Образование систем водородных связей в а-спиралях и р-складках час­ тично элиминирует полярность гидрофильной полипептидной цепи, что до­ пускает существование таких элементов внутри глобулы.

9.1.3. Третичная структура белков

Высшим уровнем пространственной организации полипептидной цепи является лишенная какой-либо периодичности третичная структура. Под этим термином понимают полную укладку в пространстве всей полипептид­ ной цепи, включая и укладку боковых радикалов. Полное представление о третичной структуре дают координаты всех атомов белковой молекулы. Такие сведения получают в первую очередь с помощью рентгеноструктурно­ го анализа и двумерной ЯМР-спектроскопии. В настоящее время такие дан­ ные получены для многих сотен белков. Сведения для каждого из белков представляют собой огромное количество информации, которую накаплива­ ют в специальных банках данных по пространственной структуре белков. Однако их обработка в большинстве случаев возможна лишь с помощью вы­

сокоэффективных ЭВМ. Эти данные позволяют получить полные сведения о геометрии белковых молекул, в частности выявить а-спирапьные участки, Р-складки и участки, не имеющие периодической структуры. Именно опира­ ясь на данные, взятые из банка данных, ученые получили все сведения о гео­ метрии фрагментов фосфоглицераткиназы, приведенные в табл. 12 и 13.

Изображение пространственной структуры молекулы в целом с приведе­ нием каждого атома и даже просто каждого аминокислотного остатка дает очень сложную, лишенную наглядности картину и практически не использу­ ется. Более наглядным и поэтому довольно часто используемым является представление структуры в виде системы цилиндров, изображающих а-спиральные фрагменты; стрелок, изображающих Р-складки, и линий, со­ единяющих элементы вторичной структуры. Острие стрелки располагают на С-конце складки. Такое изображение не подразумевает, что фрагменты цепи, соединяющие элементы вторичной структуры, не имеют достаточно жесткой пространственной структуры. Эти участки лишены простой периодичности и не могут рассматриваться как фрагменты вторичной структуры.

На рис. 70 представлена пространственная структура фосфоглицератки­ назы - фермента, детальное описание двух фрагментов которого было дано выше.

Рис. 70. Общая схема строения фосфоглицераткиназы

Видно, что фермент содержит 14 а-спиральных фрагментов и 13 Р-скла- док. Этот пример показывает, что структура отчетливо разделяется на две

достаточно автономно устроенных половины. Такие части общей третичной структуры, как уже говорилось при рассмотрении строения иммуноглобули­ нов в разд. 6.2.3, называют доменами. В большом числе случаев, если белок имеет несколько активных центров (например, если фермент катализирует реакцию между двумя или тремя субстратами), активные центры белков раз­ несены по разным доменам. В приведенном случае установлено, что один из доменов взаимодействует с АТР, а другой - с 3-фосфо-глицератом. Каждый домен имеет свою третичную структуру.

Соотношение числа Р-складок с числом а-спиралей может быть весьма разнообразным. Известны белки, которые состоят только из а-спиралей. Примером может служить белок мышечных клеток миоглобин, содержащий молекулу гема и способный присоединять в качестве одного из лигандов те­ ма молекулу 0 2, которую он получает от молекулы гемоглобина.

Рис. 71. Схема пространственной структуры миоглобина

Второй крайний случай может быть представлен структурой цепи имму­ ноглобулина, которая построена из девяти Р-складчатых элементов и не со­ держит ни одной а-спирали (рис. 72).

Но в большинстве случаев достаточно сложные белки имеют смешанные а/р-структуры. Несколько элементов вторичной структуры часто характери­ зуются определенным взаимным пространственным расположением, встре­ чающимся у целого ряда белков. Такие расположения получили название мотивов. Эти мотивы в ряде случаев имеют определенное функциональное

Как видно из рис. 74, белок состоит из ядра, образованного восемью па­ раллельными р-складками, на поверхности которого расположено восемь а-спиралей. Приведенную структуру ядра часто называют бочонком, и она встречается у большого числа белков.

9.1.4. Фибриллярные белки

Наряду с глобулярными белками в живых организмах широко представ­ лены белки, выполняющие структурную функцию. Они имеют нитевидную форму и называются фибриллярными белками. В их первичной структуре присутствуют повторяющиеся мотивы, формирующие достаточно однотип­ ную для всей полипептидной цепи вторичную структуру. Так, белок а -кера­ тин, основной белковый компонент копыт, ногтей, волос, шерсти, рогов, панцирей черепах, построен из протяженных а-спиралей. Фиброин шелка, из которого формируется куколка тутового шелкопряда, на большом протяже­ нии представлен фрагментами Gly-Ala-Gly-Ser, формирующими Р-складки. Полипептидные цепи коллагена, основного белка сухожилий, хрящей и неко­ торых других тканей, в значительной степени построены из фрагментов Gly-X-Pro и Gly-X-Hyp, где Нур - остатки гидроксипролина, а X может быть

весьма разнообразна. Последовательности аминокислот коллагена формиру­ ют левые спирали с параметрами, существенно отличающимися от таковых для а-спирали. Три таких спиральных полипептида скручены в единую су­ перспираль.

§ 9.2. Белки, состоящие из нескольких полипептидных цепей (четвертичная структура белков). Нуклеопротеиды

Большое число белков, выполняющих определенные биологические функции, состоит из нескольких полипептидных цепей, связанных некова­ лентными взаимодействиями в прочный, не разрушаемый при обычных ме­ тодах выделения комплекс. В ряде случаев полипептидные цепи дополни­ тельно ковалентно связаны дисульфидными мостиками. Этот уровень строе­ ния белков называют четвертичной структурой. Примерами белков с чет­ вертичной структурой являются уже рассмотренные инсулин (см. § 7.4, рис. 54) и иммуноглобулины (см. § 6.2, рис. 48). Отдельные полипептидные цепи, формирующие четвертичную структуру, называют субъединицами. Оп­ ределение субъединичного состава проводится путем разделения (как прави­ ло, электрофорезом) субъединиц в растворах, способствующих разрушению сильных нековалентных взаимодействий, например, в растворах гуанидина или мочевины и в присутствии додецилсульфата натрия. Если есть основания полагать, что субъединицы связаны дисульфидными мостиками, то перед разделением нужно разрушить эти связи, используя реакцию дисульфидного обмена с избытком низкомолекулярного тиола, например, меркаптоэтанола или дитиотреита.

Число белков, обладающих четвертичной структурой, очень велико. Про­ стейшими из них являются димеры, состоящие из двух одинаковых субъеди­ ниц. В этих случаях, как правило, наличие двух субъединиц связано с суще­ ствованием между ними кооперативных взаимодействий. В качестве примера можно привести триптофанил-тРНК-синтетазу. Отдельные субъединицы это­ го фермента в составе димера взаимодействуют только с одной молекулой тРНК, связывание которой делает вторую субъединицу неактивной по отно­ шению к тРНК. Субъединицы обычно обозначают греческими буквами с нижним индексом, указывающим на число каждой из разнотипных субъеди­ ниц. В данном случае четвертичная структура записывается как а 2.

Наряду с этим широко распространены комплексы, состоящие из двух структурно и функционально различных субъединиц. В случае ферментов часто одна из субъединиц является каталитической, а вторая - регуляторной. Типичным примером таких димеров являются протеинкиназы - ферменты, катализирующие фосфорилирование белков. В ряде случаев каталитическая субъединица такого фермента способна осуществлять фосфорилирование

белка-субстрата только при наличии на регуляторной субъединице специаль­ ного эффектора.

У ряда ферментов пара каталитическая-регуляторная субъединица повто­ ряется многократно. Таким ферментом является, например, аспартаткарбамоилтрансфераза, катализирующая взаимодействие аспартата с карбамоилфосфатом,

(первая стадия биосинтеза пиримидиновых оснований). Этот фермент состо­ ит из шести одинаковых пар каталитических и регуляторных субъединиц.

Число различных субъединиц может быть существенно больше двух. Из четырех различных субъединиц состоит РНК-полимераза из Escherichia coli. Она имеет структуру агрр’а. Субъединица ст необходима для взаимодейст­ вия фермента с промотором и обеспечивает правильную ориентацию фер­ мента относительно точки начала транскрипции. Ее участие в комплексе с транскрибируемой нитью ДНК нужно лишь на первый период инициации транскрипции. После образования короткого транскрипта длиной порядка 10 нуклеотидных остатков происходит отщепление субъединицы от комплекса, и дальнейшая элонгация полирибонуклеотидной цепи осуществляется в ком­ плексе агРР’ Еще более сложно устроены РНК-полимеразы эукариот. Так, РНК-полимераза II из дрожжей состоит из 12 разных субъединиц.

В живой природе широко представлены комплексы белков с нуклеино­ выми кислотами, которые называют нуклеопротеидами. Важнейшим приме­ ром нуклеопротеидного комплекса являются рибосомы, общие принципы строения которых были описаны в § 1.7. Нуклеиновые кислоты в составе этих комплексов можно рассматривать как субъединицы.

Одним из наиболее информативных подходов к изучению взаимного рас­ положения субъединиц в составе многосубъединичных белков и нуклеопротеидов является применение бифункциональных реагентов, которые содер­ жат две реакционноспособные группы и могут осуществлять химическую модификацию двух компонентов комплекса. Первая модификация может происходить по любой из субъединиц, содержащей способный к реакции ос­ таток мономера. После этого вторая модификация может проходить только по субъединице, находящейся на достаточно близком расстоянии от первой точки модификации. В результате две субъединицы оказываются ковалентно связанными (сшитыми), что дает определенную информацию об их взаимном расположении в составе многосубъединичного белка или нуклеопротеида.

Бифункциональные реагенты для изучения многосубъединичных белков могут в принципе быть созданы на основе любых соединений, способных реагировать с какими-либо боковыми радикалами аминокислотных остатков,