КНОРРЕ_3227

120 Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот

способность пуриновых гетероциклов участвовать в комплементарных взаи­ модействиях свойственна именно для шши-конформации. Оказалось воз­ можным введение в положение 2 аденина второй экзоциклической амино­ группы. Это широко используется в связи с тем, что остаток 2,6- диаминопурина обеспечивает способность олигонуклеотида к флуорес­ ценции. Возможность использования атомов С5 пиримидиновых и N7 пури­ новых гетероциклов для присоединения объемистых флуоресцирующих ра­ дикалов с сохранением способности к комплементарным взаимодействиям наглядно видна из приведенных на рис. 24 (см. § 3.3) структур флуоресци­ рующих дидезоксинуклеозид-5’-трифосфатов в качестве терминаторов при секвенировании ДНК методом Сэнгера.

Остатки фосфорной кислоты и углевода в комплементарных взаимодей­ ствиях непосредственно не участвуют. Поэтому они могут быть использова­ ны как районы присоединения функциональных групп.

Олигонуклеотиды и их производные находят применение и в качестве веществ с направленным воздействием на биологические процессы в живых организмах. В этих случаях необходимо обеспечить их стабильность в био­ логических средах, где они подвергаются воздействию нуклеаз. Поэтому встает вопрос о создании таких конструкций, которые при сохранении при­ сущей олигонуклеотидам биологической активности обладали бы повышен­ ной устойчивостью к нуклеазам или вообще не могли служить субстратами данных ферментов. В некоторых случаях этого удается достигнуть путем сравнительно простой модификации. Например, к рибонуклеазам устойчивы олигонуклеотиды, построенные из 2’-0-метилированных нуклеотидов. Такая модификация рибозного фрагмента не лишает нуклеотиды способности к комплементарным взаимодействиям.

Однако более перспективными представляются подходы, основанные на кардинальных изменениях сахарофосфатного остова, несущего гетероцикли­ ческие основания, являющиеся основными носителями информации. В настоящее время создано несколько вариантов такого остова, которые со­ храняют взаимное расположение гетероциклических оснований и тем самым способность к специфическим взаимодействиям с комплементарными нук­ леотидными последовательностями в ДНК и РНК.

Для повышения термической стабильности дуплексов предложено прово­ дить модификацию углеводного фрагмента, ковалентно закрепляя благопри­ ятную для образования дуплексов конформацию.

Наилучшие на сегодняшний день результаты получены путем образова­ ния мостика -ОСН2- между 4’ и 2’ углеродными атомами дезоксирибозы. Та­ кие нуклеозиды называют замкнутыми (locked). В этих производных гетеро­ цикл остается связанным с С-Г-атомом углеводного фрагмента.

СНо— О

Кроме того, предложены и исследованы способные к комплементарным взаимодействиям структуры с кардинально измененным сахарофосфатным остовом.

Синтезированы и испытаны аналоги, у которых углеводный фрагмент за­ менен на кольцо морфолина. Ниже приводится схема синтеза соответствую­ щих мономеров:

Их получают из рибонуклеозидов путем последовательного окисления 1/ис-диольной группы перйодатом, обработкой аммиаком для замыкания в шестичленный морфолиновый цикл, восстановлением вторичных ОН-групп боргидридом и защитой атома N морфолинового цикла тритильной группой. Процесс завершается введением по первичной ОН-группе хлордиметиламидофосфорильной группы. Образование связи между мономерными звеньями происходит в результате реакции активного хлора с деблокированным ато­ мом N морфолинового кольца. Структура фрагмента морфолиниевой поли-

нуклеотидной цепи имеет вид

Многообещающими аналогами являются полимеры, построенные из мо­ номеров, соединенных пептидными связями. Эти полимеры получили назва­ ние пептидных нуклеиновых кислот (PNA). Мономеры для таких нуклеино­ вых кислот получают алкилированием гетероциклических оснований галогенуксусной кислотой по атомам N1 пиримидиновых или N9 пуриновых гете­ роциклов с последующим ацилированием атома N аминоэтилглицина. Атом N аминоэтильного фрагмента блокирован временной защитой, удаляемой перед каждой стадией конденсации. Временные защиты для аминогрупп опи­ саны в § 10.2. Ниже приведена схема получения мономера для синтеза PNAнуклеиновых кислот на примере аналога тимина и структура фрагмента цепи

PNA.

I ‘ 9=о

'W-NH-CH2-CH2-N-CH2-C0-NH-CH2-CH2-N-C H 2-C 0v^

Все три описанные структуры аналогов способны образовывать дуплекс­ ные структуры с комплементарными рибо- и дезоксирибонуклеотидными последовательностями, причем образующиеся структуры более стабильны, чем с соответствующими нуклеотидными последовательностями. В полиме­ рах на основе морфолинового кольца связь между мономерами фосфамидная, а не фосфодиэфирная и поэтому не подвергается действию нуклеаз. В PNAаналогах связь пептидная, значит, более устойчива к действию нуклеаз.

Глава 6. Белки. Основные принципы строения и функции

§6.1. Аминокислоты и полипептиды

6.1.1.Аминокислотный состав белков и первичная структура

Белки являются линейными полимерами, построенными из «-амино­ кислот общего строения NH2-CHR-COOH, где R - различные боковые ради­ калы, в том числе атом Н, причем при физиологически значимых значениях pH NH2-rpynna протонирована, а СООН-группа ионизована.

Во всех случаях, кроме R=H, атом углерода, с которым связан боковой радикал, является асимметрическим (хиральным), т. е. возможно существова­ ние двух стереоизомеров. Однако все белки построены из одного стереоизо­ мера - L-a-аминокислот, у которого при наблюдении со стороны ато­ ма Н группа СОО , радикал R и 1ЧН3"-группа располагаются по часовой стрелке (правило CORN). Второй изомер (D-изомер) в живой природе встре­ чается, но не в составе белков.

Каждая карбоксильная группа одной из аминокислот полимерной цепи, кроме последней, образует амидную связь с аминогруппой, следующей за ней, так что две соседние аминокислоты связаны между собой амидной свя­ зью и образуют фрагмент -NH-CHRj-CO-NH-CHRj+i-CO-, где i - порядковый номер остатка аминокислоты в цепи. Амидную связь между соседними ос­ татками аминокислот принято называть пептидной связью, а полимеры - по­

липептидами.

Таким образом, практически все аминокислоты входят в состав полимер­ ной цепи в виде фрагментов -NH-CHRj-CO-. В водных растворах при биоло­ гически значимых величинах pH образующие пептидную связь группы NH и С =0 не заряжены. При нейтральных значениях pH первый в цепи остаток чаще всего находится в виде фрагмента NH3+-CHRr CO-, а последний - в ви­ де фрагмента -NH-CHRn-COO_, где п - число аминокислотных остатков в цепи.

Белки в природе образуются из 20 аминокислот, структура которых пред­ ставлена в табл. 9. Там же приведены их важнейшие физические и физико­ химические характеристики - длины волн и молярные коэффициенты экстинкции в максимумах поглощения для УФ-области спектра выше 200 нм и значения рКг групп, участвующих в кислотно-основных равновесиях. В си­ лу кислотно-основных превращений аминокислоты могут присутствовать

внескольких формах, и в табл. 9 приведены те формы, которые являются преобладающими в водных растворах при нейтральном значении pH.

При написании структур полипептидных цепей используют сокращенные трехбуквенные и однобуквенные символы для аминоацильных остатков, ко­ торые представлены в той же таблице.

Впоследнее время в некоторых белках обнаружен остаток еще одной аминокислоты - селеноцистеина, являющегося аналогом остатка цистеина,

вкотором вместо атома S находится атом селена. Соответствующий аминоацильный остаток в составе белков образуется не из аминокислоты, а специ­ альным путем, который рассмотрен при описании процесса биосинтеза бел­ ков в § 1.3.

Таблица 9 а-Аминокислоты, входящие в состав белков, их трехбуквенные и однобуквенные

символы, значения рКа и спектральные характеристики (е М 1см'1)

цистеин и тирозин, поскольку пути их биосинтеза у этих организмов из дос­ тупных предшественников отсутствуют. Однако в продуктах питания их при­ сутствие не столь обязательно, так как цистеин может легко образовываться из незаменимого метионина, а тирозин - из незаменимого фенилаланина. Ар­ гинин является незаменимой аминокислотой лишь в период интенсивного роста организмов, когда он необходим в особенно больших количествах. Умеренные потребности в аргинине у животных могут обеспечиваться за счет функционирования цикла мочевины.

Основополагающее значение для строения и функционирования белков имеют способности боковых радикалов к нековалентным взаимодействиям. В связи с этим аминокислоты классифицируют по типам нековалентных взаимодействий, характерных для их боковых радикалов. Если они представ­ ляют собой алифатические или ароматические радикалы без каких-либо за­ местителей, то они являются неполярными (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан). К неполярным относят также боковой радикал метионина, поскольку атом S не придает алифатической группе существенной полярности. В соответствии с природой боковых ради­ калов аминоацильные остатки этих аминокислот квалифицируют как гидро­ фобные. Следует подчеркнуть, что гидрофобными являются только боковые радикалы, а не сами аминокислоты, которые, кроме гидрофобного бокового радикала, имеют способную к протонированию аминогруппу и склонную к ионизации карбоксильную. Наличие групп ОН (серин, треонин, тирозин), амидных групп CO-NH2 (аспарагин, глутамин), SH-группы (цистеин), спо­ собных к образованию водородных связей, делает боковые радикалы поляр­ ными. Протонируемые аминогруппы лизина, гуанидиновая группа аргинина и имидазольное кольцо гистидина и ионизуемые карбоксильные группы аспартата и глутамата при соответствующих значениях pH вносят в боковые радикалы положительный или отрицательный заряд, что делает их способ­ ными к электростатическим взаимодействиям. В соответствии с этим амино­ кислоты в табл. 9 сгруппированы по свойствам боковых радикалов как непо­ лярные, полярные, положительно и отрицательно заряженные. Следует отме­ тить также очень существенную для структуры белков способность доста­ точно близко расположенных друг к другу в пространстве SH-групп остатков цистеина образовывать связи S-S (дисулъфидные мостики). При использова­ нии однобуквенной символики такие связи изображаются прямыми или ло­ маными линиями, соединяющими символы цистеина (см., например, форму­ лу инсулина, приведенную в § 7.4, рис. 54).

Свойства белка зависят не только от природы и количества образующих его аминокислот, но и от последовательности, в которой аминокислоты вхо­ дят в полипептидную цепь. Эту последовательность называют первичной структурой белка. В связи с этим число мыслимых полипептидов необозри­ мо велико. Оно составляет для структур, содержащих п аминокислотных ос­ татков, 20". Уже для сравнительно небольшого полипептида, состоящего из

100 аминокислотных остатков, это число составляет 2010°=10130, т. е. на пять­ десят порядков превосходит число атомов в наблюдаемой части вселенной.

6.1.2. Конформации и пространственная структура

Каждая полипептидная цепь может принимать огромное множество кон­ формаций. В результате взаимодействий фрагментов самой цепи и боковых радикалов некоторые конформации оказываются термодинамически пред­ почтительными, и белок приобретает определенную пространственную структуру. Следует оговориться, что в условиях теплового движения речь не может идти о строго фиксированных координатах атомов в молекуле белка. Однако возможна такая ситуация, что эти координаты в области некоторого энергетического (или термодинамического) минимума варьируют в очень небольших пределах. В этом смысле и говорится, что молекула белка имеет определенную пространственную структуру или конформацию.

Часто полипептидные цепи имеют несколько относительно устойчивых конформаций. Преобладание той или иной из них зависит от внешних усло­ вий. При изменении условий может происходить переход от одной устойчи­ вой конформации к другой - направленный конформационный переход.

Функционирование белков в живых организмах всегда связано с их спе­ цифическим взаимодействием с другими компонентами того же организма, внешней среды, а нередко и других организмов. Это взаимодействие обу­ словлено наличием у белка набора групп с определенным взаимным распо­ ложением, которое приводит к взаимодействию с некоторым набором групп партнера, т. е. узнавание этого партнера. Оно обеспечивает образование над­ молекулярных структур. При функционировании белка, первичным актом ко­ торого является, как правило, некоторый направленный конформационный переход, узнавание какого-либо партнера является сигналом для такого перехода.

Следует подчеркнуть, что способность к узнаванию определенных низко­ молекулярных соединений и биополимеров к направленным конформационным переходам не является каким-либо общим магическим свойством поли­ пептидов. Это свойственно лишь некоторым белкам с определенной первич­ ной и пространственной структурой. Скорее всего, большинство мыслимых полипептидов такими свойствами не обладают и, следовательно, не могут рассматриваться как белки.

6.1.3. Кислотно-основные свойства аминокислот и белков. Изоэлектрические точки

Все а-аминокислоты содержат как минимум две группы, участвующие в кислотно-основных превращениях. Карбоксильная группа может в зависи­ мости от pH среды находиться либо в нейтральной форме СООН, либо в ио­ низованной отрицательно заряженной - СОО” Аминогруппа может сущест­ вовать в нейтральной форме NH2 или в положительно заряженной -NH3+.

Кроме того, у ряда аминокислот в боковых радикалов присутствуют допол­ нительные ионизуемые СООН (аспартат, глутамат), ОН-группы (серин, трео­ нин, тирозин) и SH-группы (цистеин) или способные протонироваться NH2группа (лизин), остаток гуанидина (аргинин) и имидазольное кольцо. Значе­ ния рК, характеризующие протолитические свойства этих групп, приведены

втабл. 9. При образовании пептидной связи способность участвовать в ки­ слотно-основных превращениях при физиологически значимых значениях pH у а-аминогруппы* превращающейся в амидную, полностью исчезает, а кар­ боксильная превращается в лишенную атома Н СО-группу. Но и кислотно­ основные свойства боковых групп сильно подвержены влиянию окружения

вбелковой молекуле и могут вплоть до нескольких единиц рК отличаться от такового в составе свободной аминокислоты.

При достаточно низких значениях pH способные к протонированию боко­ вые группы вносят в молекулу белка положительный заряд, а при достаточно высоких значениях pH способные к ионизации боковые группы - отрица­

тельный. Это касается остатков аминокислот лизина, аргинина, гистидина, аспартата, глутамата, тирозина и цистеина. При достаточно кислых значениях pH первые три остатка вносят в молекулу белка положительный заряд, а ос­ тальные при достаточно щелочных значениях вносят отрицательный заряд. Могут вносить некоторый вклад концевые свободные и алкилированные амино- и неэтерифицированные карбоксильные группы.

Из сказанного следует, что при увеличении pH от низких до высоких зна­ чений заряд молекулы белка будет изменяться от положительных до отрица­ тельных значений. Значение pH, при котором заряд белка становится равным нулю, называется изоэлектрической точкой белка, она обозначается как pi. Значение изоэлектрической точки определяется аминокислотным составом белка. Эти значения для некоторых белков приведены в табл. 10.

Белок при этом значении pH обладает некоторыми характерными особен­ ностями. Во-первых, его электрофоретическая подвижность становится нуле­ вой, что позволяет в процессах разделения сосредоточить белок в определен­