КНОРРЕ_3227

Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот

§ 5.1. Общая стратегия синтеза нуклеиновых кислот. Защитные группы

Синтетические олигонуклеотиды, их аналоги и производные стали одной из важнейших групп соединений, используемых в биохимических и молеку­ лярно-биологических исследованиях, важным инструментом при решении ряда задач медицинской диагностики, широко исследуются как потенциаль­ ные терапевтические средства для лечения многих заболеваний, связанных с нарушением работы генетического аппарата организма или появлением чужеродных генетических структур. Олигонуклеотиды заданного строения необходимы в качестве праймеров при многочисленных применениях ДНКполимераз. В частности, синтетические олигонуклеотиды позволяют с ис­ пользованием генно-инженерных подходов изменять определенные нуклео­ тидные остатки в функционально значимых генах, т. е. направленно созда­ вать мутации. Экспрессия таких генов позволяет получать мутантные белки. Благодаря способности к высокоселективной гибридизации с нуклеиновыми кислотами они позволяют выявлять изменения в их первичной структуре, в том числе мутации в патогенах, в частности в патогенных вирусах. Поэтому

химический синтез олигонуклеотидов на протяжении многих лет был одной из центральных задач биоорганической химии.

Синтез олигонуклеотидов проводится исходя из готовых мономеров - нуклеозидов или нуклеотидов. Последние в настоящее время являются ком­ мерчески доступными продуктами, которые получают путем химического или ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот, выделенных из живых организмов - бактерий, дрожжей, растений и животных, с последующим раз­ делением образующейся смеси нуклеозидов или нуклеотидов на индивиду­ альные вещества. При использовании для синтеза нуклеозидов предусматри­ вается стадия введения в них остатка фосфорной кислоты или ее предшест­ венника.

Главным процессом при синтезе олиго- и полинуклеотидов является об­ разование новых связей между нуклеотидными звеньями (межнуклеотидных связей). Химический синтез является доминирующим при синтезе относи­ тельно коротких олигонуклеотидов. Для получения достаточно длинных по­ линуклеотидов используется ферментативное соединение полученных хими­ ческим путем олигонуклеотидов. Способность полинуклеотидов к реплика­ ции открыло возможность «размножать» полученные полимеры, т. е. полу­ чать необходимое количество продукта из очень незначительного изначаль-

§ 5.1. Общая стратегия синтеза нуклеиновых кислот. Защитные группы 101

ного количества. Такое «размножение» является ферментативным процессом, поскольку основано на использовании ДНК-полимераз.

Для получения олигоили полинуклеотида, состоящего из и мономерных звеньев, должно быть образовано п-1 межнуклеотидных связей. При образо­ вании каждой такой связи один из компонентов является донором ОНгруппы (О-компонент), а другой - донором атома Р для образуемой связи (P-компонент). Образование связи между ОН-группой О-компонента и остат­ ком фосфорной кислоты P-компонента, как уже указывалось в § 3.1, термо­ динамически невыгодно. Поэтому при образовании каждой новой межнуклеотидной связи используется реакционноспособное производное Р-компо- нента. Пути получения таких производных рассматриваются в § 5.3.

Общую стратегию синтеза можно представить в двух вариантах. Один из них - синтез коротких олигонуклеотидов с их последующим соединением в более длинную структуру - блочный синтез. Он был преобладающим в на­ чальный период работ по химическому синтезу нуклеиновых кислот. Второй вариант - это ступенчатое удлинение растущей цепи путем последовательно­ го присоединения нуклеотидных звеньев с одного конца. Такой вариант в настоящее время является доминирующим, а при автоматизированном син­ тезе - единственным.

При соединении Р- и О-компонентов в синтезе олигонуклеотидов с опре­ деленной последовательностью P-компонент не должен содержать ОН-груп­ пы, способной к образованию связи с атомом Р. В противном случае возмож­ на внутримолекулярная реакция образования Р-О-связи. Поэтому в Р-компо- ненте ОН-группа должна быть закрыта. Следовательно, она будет закрыта и в образовавшемся продукте, и для продолжения наращивания полинуклео­ тидной цепи ее следует деблокировать. Это достигается предварительным введением в P-компонент специальной защитной группы. Она должна при­ сутствовать на стадии образования межнукпеотидной связи и удаляться пе­ ред образованием следующей межнуклеотидной связи. Важнейшим свойст­ вом защитной группы является возможность ее удаления в условиях, не при­ водящих к разрушению ранее образованных межнуклеотидных связей. Такие защитные группы, вводимые перед каждой стадией образования новой связи и удаляемые перед следующей, рассматриваются как временные. Наряду с этим необходимо предотвратить реакции P-компонента с межнуклеотидными фосфатами и экзоциклическими аминогруппами. Это также достигает­ ся введением защитных групп, но, в отличие от временных, они должны при­ сутствовать на протяжении всего синтеза олигонуклеотида и удаляться после завершения синтеза всей олигонуклеотидной цепи. Такие защиты квалифици­ руются как постоянные.

В современных методах синтеза временной защиты требуется в основном 5’-концевая ОН-группа наращиваемой цепи, для чего в основном используют диметокситритильную группу (DMTr), которая вводится в Р-компонент взаимодействием с диметокситритилхлоридом (МеО)гТгО.

О-СНз

В силу большого объема заместителя реакция проходит достаточно се­ лективно по 5’-ОН-группе нуклеотида. DMTr-группа легко удаляется мягкой обработкой кислотой.

Наиболее широко в качестве постоянных защитных групп для межнуклеотидных фосфатов в настоящее время используются О-метильные и О-цианэтильные защитные остатки. Они, как правило, вводятся в синтоны (синтонами обычно называют производные мономеров, непосредственно ис­ пользуемые для образования новой связи между мономерами) до введения их

всинтез полинуклеотидной цепи. В наличии защитных групп на протяжении всего синтеза нуждаются также экзоциклические аминогруппы остатков цито­ зина, аденина и гуанина. С этой целью данные аминогруппы ацилируются

спомощью соответствующих ацилхлоридов. В настоящее время наиболее широко используются бензоильные производные цитозина и аденина и изобутирильные производные гуанина. Получать их исследователям не прихо­ дится, поскольку они являются коммерческими продуктами, которые постав­ ляются фирмами, обеспечивающими работы по синтезу олигонуклеотидов.

Таким образом, в синтонах при всех методах олигонуклеотидного синтеза

вкачестве гетероциклов участвуют тимин, К6-бензоиладенин, N4бензоилцитозин или Ы2-изобутирилгуанин. Деблокирование экзоциклических аминогрупп проводится по завершении синтеза олигонуклеотидной це­ пи обработкой аммиаком одновременно с удалением защитных групп с межнуклеотидных фосфатов.

§ 5.2. Методы образования межнуклеотидных связей

Пионером химического синтеза олигонуклеотидов был Гобинд Корана (Н. G. Khorana, лауреат Нобелевской премии 1968 года). В 1970 году он осу­ ществил первый синтез гена. Подходы, использовавшиеся в этих работах, были основаны на взаимодействии фосфатной группы нуклеотида или оли­ гонуклеотида в качестве P-компонента с ОН-группой О-компонента в при­ сутствии конденсирующего агента, который служил для активации фосфат­

Удлинение олигонуклеотида в Н-фосфонатном методе проводится по той же схеме, что и при фосфитамидном - ранее синтезированный олигонуклео­ тид содержит на 5’-конце защищенную диметокситритилом ОН-группу.

Защитная группа удаляется перед каждой последующей конденсацией, после чего присоединяется следующий Н-фосфонат. Н-фосфонаты активи­ руют обработкой пивапоилхлоридом (СНз)зС-С(0)С1. Межнуклеозидные Н-фосфонатные связи достаточно стабильны и могут подвергаться окисле­ нию до фосфата не постадийно, как в фосфитамидном методе, а после завер­ шения образования полинуклеотидной цепи. Конденсация приводит к обра­ зованию Н-фосфонатдиэфирной связи согласно реакции:

Метод чаще всего используют для постадийного наращивания цепи, рас­ тущей в направлении 5’-конца. В этом случае здесь R - нуклеозид, a R’ - уд­ линяемый олигонуклеотид с деблокированной 5’-концевой ОН-группой. Как и в фосфитамидном методе, каждая стадия конденсации проходит за минуты.

§ 5.3. Синтез олигорибонуклеотидов

Образование новых фосфоэфирных связей между рибонуклеотидами

имногие защитные группы, используемые при синтезе рибонуклеотидов, чаще всего не отличаются от используемых при синтезе дезоксирибонуклеотидов. Основным отличием при синтезе рибоолигонуклеотидов является на­ личие 2’-ОН-группы, и задача состоит во введении постоянной защиты по этой группе. К ней относятся все требования, предъявляемые к уже рассмот­ ренным защитным группам - она должна быть достаточно стабильна, чтобы выдерживать все промежуточные стадии сборки олигонуклеотидной цепи,

иудаляться в конце сборки в условиях, не разрушающих межнуклеотидные связи. Первая задача, которая встает при введении такой группы, - это селек­ тивное введение защитной группы именно по 2’-положению, чтобы при этом 3’-ОН-группа не затрагивалась. Очевидным и нередко используемым прие­ мом является проведение неселективной реакции, приводящей к смеси двух изомеров, и их последующее разделение для выделения нужного изомера. Подобной широко используемой группой является третбутилдиметилсилильная (TBDMSi-). Она вводится по ОН-группам обработкой соответствующим хлоридом, и образующиеся два изомера, а также продукт силилирования по обеим ОН-группам достаточно легко разделяются. Нуклеозиды с селективно

защищенной 2’-ОН-группой далее превращаются в синтоны для фосфитамидного или Н-фосфонатного олигонуклеотидного синтеза. Защитная группа удаляется после завершения синтеза всей цепи обработкой тетрабутиламмоний фторидом.

Второй подход основан на использовании реагента Маркевича - 1,3- дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксана, с помощью которого можно просилилировать одновременно 5’- и З’-ОН-группы нуклеозида (рис. 43).

Дальнейшая обработка продукта третбутилдиметилсилилхлоридом при­ водит к селективному введению защиты по 2’-ОН-группе. Остаток, образо­ вавшийся при действии реагента Маркевича, удаляется обработкой триэтиламмоний фторидом, что приводит к синтону с селективно блокированной 2’-ОН-группой. Эта группа выдерживает все последующие операции по олигонуклеотидному синтезу и удаляется обработкой 0,01 н НС1 после заверше­ ния формирования полимерной цепи с образованием требуемого олигорибонуклеотида.

Рис. 43. Получение защищенного по 2’-ОН-группе нуклеозида с помощью реа­ гента Маркевича

§ 5.4. Твердофазный метод синтеза олиго- и полинуклеотидов. Автоматические методы в олигонуклеотндном синтезе

5.4.1. Твердофазный синтез олигонуклеотидов

Специфической особенностью синтеза олиго- и полинуклеотидов являет­ ся огромное число идентичных по типу реакции стадий, которые необходимо проводить на каждом этапе удлинения цепи. Образование каждой межнуклеотидной связи требует проведения самой конденсации и удаления времен­ ных защитных групп перед проведением последующей стадии. Кроме того, при фосфитамидном синтезе после каждой стадии образования новой Р-О- связи необходимо провести окисление фосфитэфирного остатка до фосфоэфирного. Основная трудность классического синтеза состоит в том, что накаждой его стадии для гарантии чистоты полученных молекул олигомера не­ обходимо тщательно отделять их от избытка исходных синтонов, продуктов их превращения, побочных продуктов реакции и вспомогательных реагентов. Для этого на каждой стадии необходимо подбирать условия такой очистки: кристаллизация, переосаждение, хроматография и др. Кроме того, на каждой стадии очистки неизбежны некоторые механические потери синтезируемого материала. В то же время для синтеза олигомера, состоящего из п остатков мономера, нужно не менее 2п раз (а то и значительно больше!) очищать про­ дукты реакции. Таким образом, синтез в классическом варианте сопряжен со значительными затратами труда, времени и материала.

В 1963 году американский химик-биоорганик Роберт Меррифилд (R. В. Merrifield) предложил новый принцип проведения последовательных стадий удлинения растущей полимерной цепи, позволяющий в значительной мере избежать перечисленных осложнений. Было предложено осуществлять синтез нерегулярного биополимера путем пошагового удлинения полимер­ ной цепи, ковалентно связанной с нерастворимым полимерным носителем, с поочередным добавлением раствора синтона или раствора для деблокиро­ вания временной защитной группы. После проведения каждой стадии про­ цесса нетрудно осуществить отделение связанного с нерастворимым носите­ лем продукта реакции от находящихся в растворе компонентов, например, простым фильтрованием. Но более технологичным является помещение но­ сителя в колонку, через которую в нужном порядке пропускаются растворы синтонов, растворы деблокирующих и других вспомогательных реагентов и промывающие растворители. Все эти процессы, а также присоединение пер­ вого звена создаваемого полимера к носителю и удаление синтезированного продукта являются гетерогенными процессами, происходящими с участием твердой фазы. Поэтому процесс называют твердофазным синтезом биопо­ лимеров.

108 Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот

В таком варианте процесс легко поддается автоматизации. Прибор для автоматического синтеза {ген-синтезатор) состоит из колонки-реактора, в которой находится нерастворимый носитель с синтезируемым биополиме­ ром, набора сосудов для синтонов, вспомогательных реагентов, промываю­ щих растворителей и программирующего устройства, задающего порядок подачи синтонов и других компонентов.

Для удлинения могут использоваться все реакции, разработанные для обычного гомогенного синтеза, хотя специфика метода налагает свои требо­ вания к этим реакциям. Дополнительными процессами, отсутствующими при гомогенном синтезе, являются присоединение начального мономера к носи­ телю и отщепление синтезированного продукта конденсации от носителя. Последний процесс должен быть проведен таким образом, чтобы исключа­ лось повреждение продукта.

Первоначально метод был предложен Меррифидом для пептидного син­ теза, но в дальнейшем нашел столь же широкое применение для синтеза олиго- и полинуклеотидов, а также стал использоваться для получения полимер­ ных углеводов. За создание этого общего подхода к синтезу биополимеров нерегулярного строения Меррифилд в 1984 году был удостоен Нобелевской премии.

В случае твердофазного синтеза олигонуклеотидов синтез проводят, на­ чиная с 3’-конца синтезируемой цепи, для чего на нерастворимом носителе закрепляют будущий З’-концевой нуклеозид. Наиболее принятый вариант состоит в использовании нерастворимого носителя на основе производных Si02 - силикагеля или контролируемого пористого стекла (CPG - controlled pored glass), к которым присоединен остаток пропиламина, связанный через углеродный атом с атомом кремния носителя. Первый нуклеозид (в синтези­ рованном олигонуклеотиде он будет З’-концевым, т. е. последним) соединя­ ют с аминогруппой носителя через спейсер, который разрушается при завер­ шающей синтез обработке аммиаком. Широко применяют для этой цели спейсер, образованный остатком янтарной кислоты, который одной из своих карбоксильных групп связан с З’-ОН-группой закрепляемого нуклеозида, со­ держащего защищенную диметокситритильным остатком 5’-ОН-группу, а второй карбоксильной группой связан с аминогруппой носителя. После де­ блокирования 5’-ОН-группы начинается собственно синтез, который в этом случае состоит в ступенчатом удлинении в направлении 5’-конца синтези­ руемого олигонуклеотида. Используются уже описанные процедуры: удале­ ние диметокситритильной группы мягкой кислотной обработкой и присоеди­ нение очередного мономера. Такая схема применима как для синтеза дезоксиолигорибонуклеотидов, так и рибоолигонуклеотидов, причем и в фосфитамидном, и в Н-фосфонатном варианте.

Отсутствие промежуточных очисток растущего на растворимом носителе олигонуклеотида приводит к накоплению ошибок, неизбежно возникающих на каждой стадии. Это естественно происходит и при синтезе на твердой фа­

зе других полимеров нерегулярного строения. Самая неприятная ошибка - это неполное проведение реакции конденсации с каждым очередным синтоном, что неизбежно приводит к получению олигонуклеотидов с укороченной последовательностью и пропусками. Поэтому каждую стадию конденсации проводят, используя достаточно большие избытки синтонов. Чтобы избежать по возможности пропусков, после обработки растущей цепи очередным синтоном проводят обработку уксусным ангидридом. Эта небольшая, по сравне­ нию с синтоном, молекула может дотянуться до тех 5’-ОН-групп, которые по стерическим причинам не вступили в реакцию с синтоном. Ацетилирование ОН-групп делает их недоступными для реакции с последующими синтонами. Данная стадия получила название копирования (при синтезе). Она является обязательным звеном при синтезе на полимерном носителе.

Так как каждое звено цикла предполагает проведение деблокирования 5’-ОН-группы и последующую конденсацию с очередным синтоном, стадию кэпирования, а в случае фосфитамидного метода также стадию окисления, то между этими реакциями нужна промывка полимера от растворителя, исполь­ зуемого на предыдущей стадии, и от избытка используемого на этой стадии реагента. Указанные элементы схемы существенны при любом методе синте­ за - фосфотриэфирном (в автоматическом варианте он в настоящее время практически не применяется), фосфитамидном и Н-фосфонатном. В случае фосфитамидного метода после образования очередной связи необходимо провести окисление фосфитной связи до фосфатной. На заключительной ста­ дии, помимо деблокирования защитных групп, проводится отщепление обра­ зовавшегося олигонуклеотида от носителя. Выделенный олиго-(поли-)нук- леотид далее подвергается очистке, поскольку даже при очень высоких вы­ ходах на стадиях конденсации не удается полностью избежать некоторой примеси более коротких олигонуклеотидов. Окончательная очистка, как пра­ вило, проводится с помощью анионообменной хроматографии или гельэлектрофореза, которые разделяют смесь полученных продуктов по длине.

Схема автоматического синтеза приведена на рис. 44 на примере фосфи­ тамидного синтеза.

В настоящее время автоматические синтезаторы олигонуклеотидов, кото­ рые часто называются ген-синтезаторами, выпускаются серийно рядом фирм и стали рутинными приборами во многих молекулярно-биологических лабо­ раториях. Существует и отечественное производство таких синтезаторов.

Сама работа с надежно функционирующими синтезаторами является дос­ таточно простой. Но, учитывая отсутствие промежуточных очисток, необхо­ димо иметь максимально очищенные используемые вещества и в первую оче­ редь высокоочищенные синтоны. При этом условии в настоящее время уда­ ется синтезировать полимеры длиной порядка сотни нуклеотидов. Однако чтобы добиться на каждой стадии конденсации максимального выхода при каждом удлинении, приходится использовать значительные избытки синто­ нов, что при отсутствии эффективных методов регенерации непрореагиро-