КНОРРЕ_3227

присутствующих в исследуемых белках. Для выбора этих реагентов полезно предварительно иметь сведения об аминокислотном составе белков, форми­ рующих изучаемый комплекс. Выбранные группы соединяются с помощью специального связующего их спейсера {линкера).

Для изучения нуклеопротеидов используются реагенты, у которых одна из групп реакционноспособна к каким-либо боковым радикалам аминокис­ лотных остатков, а другая - к боковым радикалам нуклеотидов. Образовав­ шиеся при действии бифункциональных реагентов продукты сшивки могут быть разделены с помощью хроматографии или электрофореза.

Первоочередной задачей после их выделения является выяснение, какие именно компоненты комплекса оказались сшитыми. Каждый из компонентов комплекса в используемой системе разделения имеет определенное положе­ ние, которое позволяет его идентифицировать. Однако, будучи сшитым с по­ мощью бифункционального реагента с каким-либо другим макромолекулярным компонентом комплекса, он, естественно, займет в этой системе разде­ ления совершенно другое положение. Поэтому особенно перспективным яв­ ляется использование таких бифункциональных реагентов, содержащие на­ ряду с наличием двух реакционноспособных групп группу (функцию), по ко­ торой после выделения можно расщепить линкер, после чего сшитые компо­ ненты могут быть разделены. В используемой для разделения системе они займут положение, близкое к положению исходных компонентов, от которых они отличаются лишь небольшими дополнительными остатками при моди­ фицированных аминокислотах в составе биополимеров. Такие реагенты на­ зываются полифункциональными.

В качестве конкретного примера использования подобного типа реаген­ тов можно привести широко применяемый для этих целей иминотиолан, взаимодействующий с остатками лизина и вводящий в модифицируемые бел­ ки остатки SH. Последующее окисление приводит к образованию S-S-мости- ков между сшитыми белками. После выделения сшитых белков мостики мо­ гут быть легко разрушены с образованием белков, которые отличаются от сшиваемых белков всего лишь наличием небольших дополнительных остат­ ков HS-(CH2)3-C=NH:

Такая же методология используется и для изучения организации нуклеопротеидов, к числу которых относятся рибосомы, нуклеосомы и вирусы. В этом случае целесообразно использовать такие бифункциональные реаген­ ты, у которых одна из реакционноспособных групп реагирует преимущест­ венно с какими-либо аминокислотными остатками, а другая - с остатками нуклеотидов.

В качестве реакционноспособных групп бифункциональных реагентов нашли применение имидоэфирные группы, реагирующие с 8-аминогруппами остатков лизина; эпоксигруппы, реагирующие с атомами N7 остатков гуани­ на, e-аминогруппами остатков лизина и SH-группами остатков цистеина; диаминодихлорплатина, образующая координационные соединения с остат­ ками серусодержащих аминокислот, имидазольным кольцом остатков гисти­ дина и атомами N7 остатков гуанина; азиридиновое кольцо, образующее при облучении радикалы карбена; азидогруппы, образующие при облучении ра­ дикалы нитрена, и многие другие.

В табл. 14 приведены некоторые бифункциональные реагенты с расщеп­ ляемыми спейсерами, которые использовались для изучения четвертичной структуры бактериальных рибосом и их субъединиц. В качестве расщепляе­ мых в приведенной таблице показаны спейсеры с S-S-фрагментами, которые легко разрушаются окислением или обработкой тиолами; с диэпоксигруппа­ ми, которые после алкилирования превращаются в г/мс-диольные, расщеп­ ляемые окислением перйодатом, омыляемыми сложноэфирными группами - С(0)0-. Сшивка диаминодихлорплатиной может быть разрушена добавлени­ ем тиомочевины.

Таблица 14 Структурные формулы некоторых бифункциональных реагентов

Глава 10. Химический синтез пептидов и белков

§ 10.1. Общие проблемы химического синтеза полипептидов

Пептидная связь образуется при взаимодействии N-компонента, являю­ щегося донором амидной группы, и С-компонента - донора карбонильной группы. Для химического синтеза полипептида длиной п аминокислотных остатков необходимо образовать п-1 пептидную связь. Как и при синтезе олиго- и полинуклеотидов, это может быть достигнуто либо блочным методом путем синтеза нескольких более коротких пептидов и их последующим со­ единением, либо ступенчатым наращиванием растущей полипептидной це-пи аминоацильными остатками с N- или С-конца. В настоящее время преимуще­ ственно используется ступенчатый синтез с наращиванием цепи с N-конца.

Первый синтез биологически активного пептида был осуществлен Дю Виньо и его коллегами в 1953 году. Ими были синтезированы два девяти­ звенных пептидных гормона - окситоцин и вазопрессин. За этим последовал синтез 39-звенного адренокортикотропного гормона, основной функцией ко­ торого является стимуляция коры надпочечников.

В начале 1960-х годов был осуществлен синтез человеческого инсулина - важного препарата для лечения такого распространенного заболевания, как сахарный диабет, вызываемый недостатком или отсутствием у больного ин­ сулина. Этот препарат нужен в больших количествах, так как его нужно вво­ дить больным ежедневно в виде инъекций. Структура человеческого инсули­ на, который длительное время использовался в качестве основного препарата для ежедневных инъекций больных диабетом, приведена на рис. 75. Химиче­ ский синтез инсулина был важным достижением биоорганической химии, хотя в настоящее время этот метод получения инсулина не используется. Че­ ловеческий инсулин получают генно-инженерными методами. Как видно из приведенной формулы на рис. 75, инсулин состоит из двух полипептидных цепей: цепи А, состоящей из 21 аминокислотного остатка, и цепи В (30 ами­ нокислотных остатков), соединенных двумя дисульфидными мостиками.

Наконец, в 1969 году был завершен первый синтез фермента - РНКазы из поджелудочной железы (РНКазы А), катализирующей расщепление РНК по межнуклеотидным остаткам, связывающим пиримидиновый нуклеотид со следующим за ним произвольным рибонуклеотидом.

Пептидная связь - прочная связь. Это находит отражение в величине сво­ бодной энергии гидролиза амидной связи, AG0Pudp « -12 кДж/моль (от -3 до -4 ккал/моль). Для образования пептидных связей необходимо затратить энергию. Это достигается либо использованием активированного производ-

§ 10.2. Методы образования пептидных связей. Метод смешанных ангидридов 205

Z-NH-CHRrCO-NH-CHR/.r CO-NH •

где Z - временная защитная группа, R - защищенные боковые радикалы, X - остаток, активирующий карбоксил. По этой схеме синтез проводится в на­ правлении N-конца создаваемой цепи.

Защитные группы, кроме своей основной функции (предотвращение не­ желательных реакций), могут выполнять некоторые «дополнительные» функ­ ции: изменять растворимость пептида, его гидрофобность, молекулярную массу и т. д.

Наконец, для получения пептидов и белков необходимо сохранение опти­ ческой чистоты получаемых продуктов. Между тем активация карбоксиль­ ной группы и само образование пептидной связи в той или иной мере сопро­ вождается некоторым обращением конфигурации при а-углеродном атоме, т. е. рацемизацией аминокислотного остатка. Механизм рацемизации и мето­ ды, позволяющие в наибольшей мере избежать ее, рассмотрены в § 10.9.

§ 10.2. Методы образования пептидных связей. Метод смешанных ангидридов

Первые работы по образованию пептидных связей между аминокислота­ ми были выполнены в самом начале XX века. Эмиль Фишер (Fischer, 1903) применил для этого ацилирование а-аминогруппы одной аминокислоты хлорангидридом другой аминокислоты, защищенной с помощью группы Z по аминогруппе:

Z-NH-CHR-C(0)-Cl + NH2 CHR1 C (0)0C 2 H5 ->

-» Z-NHCHRC^NHCHR^COOCzHs

где Z - защитная группа.

Теодор Курциус (Curtius, 1902) предложил для той же цели азидный ме­ тод, в котором ацилирующим агентом служил азид защищенной по амино­ группе аминокислоты, получавшийся последовательной этерификацией кар­ боксильной группы, превращением эфира в гидразид, обработкой гидрази­ ном и превращением последнего в азид обработкой азотистой кислотой:

Z-NH-CHRi-C(0)0C2 H5 + NH2 NH2^ Z-NHCHRACONHNHz

Z-NHCHR^CONHNHz + HN02^ 1ЧН2 СН^С(0)М 3

Z-NHCHR^CONs + NH2 CHR2 COOZ’ -> Z-NHCHR^ONHCHRzCOOZ'

где Z, Z’ - защитные группы, Ri,R.2- боковые радикалы.

Оба подхода могут квалифицироваться как метод смешанных ангидри­ дов, поскольку хлорангидриды рассматриваются как смешанные ангидриды аминокислоты и НС1, а азиды - как смешанные ангидриды с азотистоводо­ родной кислотой HN3.

Вдальнейшем были использованы и другие смешанные ангидриды, но

внастоящее время метод смешанных ангидридов не используется в связи

ссозданием более эффективных и менее осложненных рацемизацией мето­ дов, рассматриваемых в следующих разделах этой главы.

Стоит упомянуть применение внутримолекулярных ангидридов, обра­ зующихся при обработке а-аминокислот фосгеном. При реакции с фосгеном аминогруппа образует фрагмент хлорангидрида карбаминовой кислоты, ко­ торый затем взаимодействует с а-карбоксильной группой, превращаясь в N- карбоксиангидрид (ангидрид Лейкса, по имени получившего его автора).

м

£ = ° О CI

Такие ангидриды могут использоваться для ступенчатого синтеза пепти­ дов, но свое основное применение они нашли для синтеза полиаминокислот, сыгравших большую роль в установлении общих принципов формирования пространственной структуры белков. В присутствии нуклеофила Nu, роль которого, в частности в щелочной среде, могут играть а-ЫН2-группы следо­ вых количеств свободной аминокислоты, происходит ацилирование нуклео­ фила с освобождением фрагмента карбаминовой кислоты. При слабокислых pH последний декарбоксилируется, и освобождается новая аминогруппа, ко­ торая в щелочной среде может ацилироваться новой молекулой ангидрида Лейкса.

208Глава 10. Химический синтез пептидов и белков

§10.3. Карбодиимидный метод синтеза

Как уже говорилось в начале этой главы, для осуществления процесса об­ разования пептидной связи необходимо затратить энергию. Одним из подхо­ дов к решению этой задачи является карбодиимидный синтез - образование пептидной связи сопряженно с гидратацией дизамещенных карбодиимидов, протекающей по реакции

X1-N=C=N-X2 + Н20 -» X^NH-CO-NH-Хг

Этот реагент, введенный в практику пептидного синтеза в 1955 году Дж. Шиеном и Г. Гессом, в дальнейшем сыграл важную роль в решении це­ лого ряда задач химии пептидов и нуклеотидной химии. Авторы предложили использовать для конденсации двух аминокислот М,И'-дщиклогекст- карбодиимид (ДЦК). При смешении в эквимолярных количествах N- защищенной аминокислоты и сложного эфира другой аминокислоты в при­ сутствии этого реагента происходит быстрое образование пептидной связи, а побочный продукт реакции (Л^Л^'-дициклогексилмочевина, ДЦГМ) легко удаляется благодаря чрезвычайно низкой ее растворимости в применяемых для проведения реакции растворителях. В некоторых случаях целесообразно использовать карбодиимиды с другими заместителями. В частности, нашли разнообразное применение водорастворимые карбодиимиды, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолинийэтил)карбодиимид (в виде и-толуолсульфо- ната) и 1-этил-3(3-диметиламинопропил)карбодиимид.

н3с

C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2

Активация карбоксильной группы аминокислоты происходит в результа­ те атаки карбоксилат-аниона на атом С протонированного карбодиимида. Повидимому, при этом образуется активное промежуточное соединение - дизамещенная 0-ацилизомочевина. Последняя, скорее всего в протонированной форме, атакует а-аминогруппу N-компонента с образованием пептидной свя­ зи с защищенной по N-концу второй аминокислотой, образуя соответствую­ щий пептид.

coz2

Из-за высокой реакционной способности О-ацилизомочевина обладает низкой селективностью к различным кислород- и азотсодержащим нуклео­ филам. Поэтому аминолиз обычно сопровождается конкурентными реакция­ ми с другими нуклеофилами, в том числе со вторым карбоксилат-анионом с образованием ангидрида, с атомом N второй молекулой карбодиимида с образованием N-ацилмочевины и внутримолекулярной реакцией с атомом N собственной а-амидной группой с образованием 5(4Н)-оксазолона. (В ли­ тературе эту же структуру можно встретить под названиями азлактон, дигид- рооксазол-1,3-он-5, оксазолинон, 1,3-оксазолинон-5, 2-оксазолинон-5.)

NHZ!

Образующийся в этой реакции ангидрид достаточно реакционноспособен и может реагировать с TV-компонентом с образованием пептидной связи. При этом от ангидрида отщепляется С-компонент, который может снова активи­ роваться карбодиимидом и образовывать новую пептидную связь. Образова­