КНОРРЕ_3227

250 Глава 11. Химические методы дериватизации белков и нуклеиновых кислот

продуктами, выпускаемыми специальными фирмами, с разнообразными ха­ рактеристиками, такими как размер, форма и степень однородности частиц носителя, их механическая прочность и скорость протекания элюента или растворов реагентов через слой частиц.

Среди уникальных свойств биополимеров существенно выделяются два. Первое - это способность биополимеров к высокоспецифичному узнаванию некоторых определенных низко- и высокомолекулярных соединений. Это нашло широкое применение в выделении таких соединений из сложных сме­ сей и для их тонкой очистки. Иммобилизация биополимера, специфично уз­ нающего какого-либо партнера, позволяет получить сорбент, обладающий высоким селективным сродством к такому партнеру определенных биополи­ меров (§ 12.1).

Второй важной для физико-химической биологии особенностью является наличие у некоторых биополимеров способности высокоспецифично и эф­ фективно катализировать определенные химические реакции, т. е. служить ферментами. Катализ ферментами в силу их специфичности, мягких условий протекания реакций и огромной скорости катализируемых ими химических превращений в мягких условиях давно привлекает внимание химиков, заня­ тых препаративными методами получения различных веществ, и химиковтехнологов. Однако камнем преткновения на пути к широкому использова­ нию ферментов в препаративной химии, и в особенности в химической про­ мышленности, остается их дорогая цена и сложность повторного использова­ ния в силу их лабильности, препятствующей выделению из отработанной ре­ акционной смеси. Значительная часть этих проблем исчезает при использова­ нии иммобилизованных ферментов. В таком виде ферменты становятся гете­ рогенными катализаторами и обладают всеми основными достоинствами, свойственными гетерогенному катализу. Они позволяют проводить фермен­ тативные процессы в потоке раствора субстрата (субстратов) до исчезновения каталитической активности в результате неизбежной инактивации катализа­ тора. Это эквивалентно многократному использованию фермента. По окон­ чании процесса, если продукты реакции остаются в той же фазе, они также легко отделяются от катализатора. Эти достоинства исчезают при проведении ферментативной реакции в растворе.

Несмотря на всю привлекательность подхода, иммобилизованные фер­ менты пока не нашли широкого применения. Среди процессов, имеющих тех­ нологическое применение, одним из первых была иммобилизация ацилазы пенициллина G, дающая 6-аминопенициллановую кислоту, исходя из кото­ рой было получено множество полусинтетических производных и глюкозоизомеразы, катализирующей превращение глюкозы в фруктозный сироп.

Естественно, что ковалентная иммобилизация белков проводится путем реакции каких-либо групп носителя с группами боковых радикалов биополи­ меров.

Для связывания с 8-аминогруппами остатков лизина удобными являются носители, содержащие альдегидные группы. Они легко образуют основания

§ ILL Иммобилизация биополимеров на нерастворимых носителях 251

Шиффа, которые восстанавливаются до аминогрупп цианоборгидридом на­ трия.

При наличии в иммобилизуемом биополимере сульфгидрильных групп можно воспользоваться реакцией алкилирования привязанными к носителю иодацетильными остатками.

В большинстве случаев количество остатков цистеина существенно меньше, чем остатков лизина, т. е. место расположения реакционноспособной группы носителя будет более определенным. Еще точнее можно задать поло­ жение остатка цистеина, если в качестве химически активной группы на но­ сителе использовать синтетический пептид с остатком цистеина, введенным на С-конец в ходе синтеза.

Иммобилизацию за карбоксильную группу аспартата или глутамата мож­ но провести, используя носитель с первичными аминогруппами по реакции с карбодиимидом:

( р ) — NH2 + R-COOH + X-N=C=N-X' -------► ( р ) —NH-CO-R + X-NH-CO-NH-X'

Применять следует водорастворимый карбодиимид, поскольку обра­ зующаяся при реакции дизамещенная мочевина не должна выпадать в оса­ док и смешиваться с носителем.

Для решения ряда задач оказываются полезными иммобилизованные хелатирующие группы, которые позволяют иммобилизовать ионы переходных металлов. В качестве хелатирующих групп широко используются остатки нитрилотриуксусной Ы(СН2СООН)з и иминодиуксусной МЩСНгСООНЬ кислот.

Для иммобилизации олигонуклеотидов целесообразно уже в процессе их синтеза вводить специальные радикалы для связывания с носителем. Напри­ мер, можно присоединить к одному из концов остаток гексаметилендиамина и иммобилизовать по реакции с альдегидными группами, как это было опи­ сано для иммобилизации белков через остатки лизина.

Поскольку речь идет об иммобилизации биополимеров с уникальными свойствами, ее следует проводить так, чтобы эти свойства не были сущест­ венно повреждены. Источником подобных повреждений может быть та хи­ мическая реакция, которая используется для иммобилизации.

252 Глава 11. Химические методы дериватизации белков и нуклеиновых кислот

Например, при восстановлении оснований Шиффа при иммобилизации бел­ ков на альдегидные группы носителя не рекомендуется применять боргидрид лития, поскольку он, в отличие от более мягкого восстановителя - цианоборгидрида, может восстанавливать дисульфидные мостики в белках, необходи­ мые для сохранения их нативности.

Вторым источником повреждений может быть взаимодействие иммоби­ лизованного биополимера с носителем. Этого можно в значительной мере избежать, используя для удаления его от носителя спейсеры достаточной длины. В качестве примеров выпускаемых носителей с такими группами можно привести носители, несущие иммобилизованные остатки диаминодипропиламина и остаток иминодиуксусной кислоты, например:

( р ) — NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )3 -NH2

§ 11.2. Введение меток в белки и нуклеиновые кислоты для их последующей детекции

Для решения широкого спектра задач с участием нуклеиновых кислот и белков необходимо «увидеть» определенные биополимеры в реакционных смесях, в составе сложных надмолекулярных комплексов, в органеллах или даже в клетках. Это может быть достигнуто введением в них специальных меток. Наиболее широко с этой целью используются радиоактивные и флуо­

ресцирующие метки.

В качестве радиоактивных меток наиболее широко используют радиоак­ тивные изотопы водорода (3Н, тритий, период полураспада 12,26 лет), угле­ рода (14С, период полураспада 5570 лет), фосфора ( 2Р и 33Р, периоды полу­ распада 14,3 и 25 дней), серы (35S, период полураспада 87 дней) и йода (1251 и 1291 с периодами полураспада 60 дней и 2x107 лет). В силу простоты регист­ рации присутствия радиоактивности в промежуточных и конечных продуктах превращения меченых субстратов применение радиоактивных меток стало одним из основных подходов для изучения механизмов химических превра­ щений, в том числе и биохимических.

Такие важные для биоорганической химии элементы, как азот и кислород, имеют лишь очень короткоживущие радиоактивные изотопы. Даже наиболее долгоживущие изотопы этих элементов имеют периоды полураспада порядка минут: азота 13N - 10,1 мин, кислорода 150 - 2 мин. Оба эти изотопа являются излучателями позитронов ([Г-распад). Такие изотопы для решения задач,

направленных на изучение механизмов реакции, пока что нашли ограничен­ ное применение. Основное использование радиоактивных изотопов в химии основано на методе меченых атомов, с помощью которого исследуются пути превращения различных химических соединений. Для этого в исследуемые соединения и известные или предполагаемые продукты их превращения вво­ дится радиоактивный изотоп, т. е. получается меченое соединение, и наблю­ дается по радиоактивности их накопление или расходование. Если, как в слу­ чае изотопов О и N, их время жизни измеряется минутами, то соответственно и получение меченых соединений или промежуточных соединений и измере­ ние их концентрации по ходу процесса также должно проводиться за доли минут. В принципе, в ряде случаев этого можно достигнуть, особенно если для получения меченых соединений можно использовать ферментативные методы.

Для изучения механизма реакций наряду с радиоактивными изотопами находят широкое применение стабильные изотопы водорода 2Н (дейтерий, D), углерода 13С, азота l5N, кислорода 170 ,180.

Для нуклеиновых кислот наиболее широко используется меченая 32Р фосфорная кислота. [у-32Р]АТР является донором остатка меченой фосфорной кислоты при многочисленных реакциях фосфорилирования углеводов, липи­ дов и других соединений. Этот реагент, в частности, является субстратом фермента полинуклеотидкиназы, который катализирует перенос остатка фосфорной кислоты на 5’-концевой фрагмент олигоили полинуклеотидной цепи. Фермент продуцируется клетками Е. coli, инфицированными фагом Т4, что позволяет получать меченные по концевому фосфату олигонуклеотиды и нуклеиновые кислоты. Аналогичным образом может использоваться изотоп 33Р.

Полностью меченная по всем остаткам фосфорной кислоты нуклеиновая кислота получается при репликации и транскрипции с использованием в ка­ честве субстратов [а-32Р]-нуклеозидтрифосфатов с меченым остатком фос­ форной кислоты, ближайшим к нуклеозиду (а-фосфат), так как только этот остаток входит в состав синтезируемого полимера - два остальных остатка фосфорной кислоты в ходе синтеза отщепляются в виде пирофосфата.

Введение в анализируемые соединения изотопов водорода часто можно осуществить путем обмена с меченой водой. В этом случае заменяемые ато­ мы Н должны в определенных условиях достаточно легко ионизоваться и в то же время сохраняться в составе меченой молекулы во время эксперимента. Этим условиям, в частности, удовлетворяют атомы Н в положении С5 пири­ мидиновых и атомы С8 пуриновых оснований. Замена атома Н, связанного с атомами N или О, на его изотопы в водном растворе проходит очень легко, но метка нестабильна в водных растворах и быстро обменивается с молеку­ лами воды.

Получение соединений, содержащих вместо основного природного изо­ топа 12С значительное, превосходящее природное содержание стабильного изотопа 13С или радиоактивный 14С, возможно лишь путем химического син­ теза необходимого соединения с использованием меченого предшественника

254 Глава 11. Химические методы дериватизации белков и нуклеиновых кислот

или, если соединение получается из природных источников, выращиванием необходимого соединения на среде, содержащей меченый предшественник. Так, если необходимо приготовить меченое соединение, которое получается исходя из дрожжей или бактерий, то последние следует выращивать на среде, содержащей в качестве источника углерода меченый бикарбонат. Это же от­ носится к получению меченных по сере сложных органических молекул цистеина и метионина.

Второй подход, широко используемый для наблюдения за биополимерами

висследуемых системах, основан на введении в биополимеры флуоресци­ рующей метки. В случае нуклеиновых кислот это может быть достигнуто пу­ тем введения в пиримидиновые гетероциклы по положениям С4 или С5 спейсера с алифатической аминогруппой, по которой можно ввести флуоресцент­ ные метки.

Как уже указывалось в § 3.2, нуклеозидтрифосфаты, содержащие моди­ фицированные по С4 или С5 радикалы, в ряде случаев могут служить суб­ стратами полимераз нуклеиновых кислот. Это открывает возможность ввести алифатические аминогруппы в состав олиго- и полинуклеотидов. По таким аминогруппам можно проводить дериватизацию олигонуклеотидов и нуклеи­ новых кислот, в том числе вводить в них флуоресцентные метки. Однако

вотличие от радиохимического подхода в этом случае в состав нуклеиновой кислоты вводится объемистый радикал, который может существенно повли­ ять на свойство исследуемой нуклеиновой кислоты, так что в каждом кон­ кретном случае следует выяснить, в какой мере введенная метка влияет на исследуемые свойства нуклеиновой кислоты: способность специфично взаи­ модействовать с определенными партнерами и претерпевать направленные конформационные переходы в результате таких взаимодействий или дейст­ вия специфических эффекторов.

Примеры используемых флуоресцентных меток для нуклеиновых кислот уже приводились в § 4.3 в связи с рассмотрением подходов по секвенированию нуклеиновых кислот методом Сэнгера.

Глава 12. Специфические взаимодействия биополимеров. Природа и применение в биоорганической химии

§ 12.1. Аффинные сорбенты

Большинство объектов биоорганической химии выделяются из природ­ ного материала (биомассы), представляющего собой смесь большого числа различных веществ. Для их выделения используются все основные приемы, применяемые в химии нелетучих соединений - осаждение, кристаллизация, различные классические виды хроматографии. Однако при выделении инди­ видуальных биополимеров этого в ряде случаев оказывается недостаточно. Для окончательного решения вопроса используется способность подлежа­ щего выделению объекта к высокоселективному взаимодействию с некото­ рым определенным биополимером-партнером. Наиболее технологичным вариантом использования таких партнеров является их иммобилизация на нерастворимом носителе. Это позволяет сорбировать выделяемый объект из раствора, отделив его от всех других присутствующих в том же растворе компонентов, а затем его десорбировать соответствующим изменением условий.

Такие функционирующие на основе высокого сродства (аффиности) сорбенты получили название аффинных сорбентов. Эффективность разде­ ления, основанного на сорбционных методах, существенно возрастает при использовании этих методов в хроматографическом варианте. При хромато­ графии разделяемая смесь наносится узкой полоской на колонку с сорбен­ том или на определенную точку листа специальной хроматографической бумаги и перемещается вместе с током растворителя. Из-за различия срод­ ства разделяемых веществ к сорбенту они отличаются по времени удержи­ вания на сорбенте и выходят с сорбента через различное время в виде от­ дельных фракций. В случае применения этого метода с использованием аф­ финных сорбентов его квалифицируют как аффинную хроматографию.

Число конкретных задач по фракционированию сложных смесей и выде­ лению индивидуальных веществ очень велико. Выбор биополимеров и дру­ гих соединений для иммобилизации определяется типом решаемой задачи. Для выделения какого-либо фермента можно иммобилизовать на носителе либо субстрат этого фермента, либо какой-либо аналог, обладающий специ­ фичным сродством к этому ферменту, например, конкурентный ингибитор.

Для выделения тех белков, к которым получены моноклональные антите­ ла, можно воспользоваться их иммобилизацией, т. е. получить иммуносор­ бенты. Иммобилизовав какой-либо антиген, можно из смеси иммуноглобу­ линов выделить те, которые специфичны к этому антигену.

Сорбенты, содержащие иммобилизованные олигонуклеотиды, могут быть использованы для выделения нуклеиновых кислот, содержащих последова­ тельности, комплементарные иммобилизованным нуклеотидам. Особенно широкое применение нашли сорбенты с иммобилизованными олиготимидилатами или олигоуридилатами. Так как мРНК содержат на 3’-конце поли(А) фрагменты, то такие сорбенты позволяют отделять мРНК от суммы других РНК.

Одним из приложений аффинной хроматографии является выделение ин­ дивидуальных тРНК из их смеси. Например, используя сорбент, несущий олигонуклеотид pTpTpCpApG, комплементарный участку 32-36 антикодоновой петли фенилаланиновой тРНК, удалось добиться 100-кратной очистки этой тРНК, получив препарат, близкий к индивидуальному.

Высокую разрешающую силу аффинной хроматографии для разделения сложной смеси олигонуклеотидов демонстрирует хроматограмма на рис. 79. В качестве примера решения достаточно сложной задачи, решаемой с помо­ щью аффинной хроматографии, можно привести разделение смеси диасте-

реоизмерных олигонуклеотидов GpCpCp(OC2H5)Ap(OC2H5)Ap(OC2H5)ApCpA

на колонке с иммобилизованным на аминосилохроме комплементарным оли­ гонуклеотидом pdTpdGpdTpdTpdTpdGpdGpdC. Нефракционированный оли­ гонуклеотид с тремя хиральными центрами должен содержать 23 = 8 диастереомеров. Как видно, получено шесть фракций, т. е. значительная часть изо­ меров выделяется в индивидуальном виде.

Рис. 79. Профиль элюции смеси 8 диастереоизомеров с колонки с иммобилизо­ ванным на аминосилохроме комплементарным олигонуклеотидом

Аффинные сорбенты с иммобилизованными олигонуклеотидами могут быть использованы и для выделения белков, обладающих сродством к опре­ деленным нуклеотидным последовательностям. В качестве примера можно привести выделение фермента рестрикции Fokl. Этот фермент относится к группе ферментов рестрикции (см. § 3.2), которые обладают сродством к оп­ ределенной последовательности нуклеотидов, но проводят расщепление вда­

ли от специфической области узнавания. Рестриктаза FokI узнает дуплекс, образованный комплементарными олигонуклеотидными фрагментами pd(GGATG) и pd(CATCC), но расщепляет нуклеиновую кислоту после 9-го нуклеотида от места узнавания первого из олигонуклеотидов и 13-го от места узнавания второго олигонуклеотида. В описываемом случае на носителе был иммобилизован олигонуклеотид pd(TTGGATGACGCATCTT), а для образо­ вания дуплекса в элюирующий раствор был добавлен комплементарный оли­ гонуклеотид 3’d(AACCTACTGCGTAGAA) (последовательности, узнаваемые ферментом, подчеркнуты). В отсутствие этого олигонуклеотида элюция сор­ бированной рестриктазы происходила при концентрации NaCl в элюирую­ щем растворе 0,16 М, а при наличии в среде дополнительного олигонуклео­ тида, формирующего полноценный сайт узнавания, элюция фермента проис­ ходила только в растворе 0,28 М NaCl.

Аффинная хроматография является важным элементом при получении рекомбинантных белков, образующихся путем экспрессии рекомбинантных ДНК. Поскольку экспрессия проводится в клетках, такие белки получаются в составе сложной смеси. Для выделения индивидуального рекомбинантного белка в ряде случаев удобно снабдить его дополнительной группой, обеспе­ чивающей его специфическую сорбцию на специально приготовленном сор­ бенте. Так, широкое применение нашли рекомбинантные белки, у которых на С-конце присутствует цепочка из нескольких (обычно шести) остатков гис­ тидина. Этот фрагмент обеспечивает высокое сродство к иммобилизованным на сорбенте хелатирующим реагентам, таким как нитрилоуксусная или иминодиуксусная кислота. С такого сорбента присоединившийся белок может быть удален избытком имидазола.

Для выделения гликопротеидов широко используются иммобилизован­ ные лектины - белки, обладающие специфическим сродством к гликопро­ теидам, например конкановалин.

§ 12.2. Аффинная модификация биополимеров. Необратимые ингибиторы ферментов и рецепторов

Химические воздействия на белки и нуклеопротеиды (химическая моди­ фикация), как правило, приводят к потере ими функциональной активности, если модифицируемые остатки принимают участие в формировании функ­ ционально значимых областей. Поэтому химическая модификация может служить источником информации о структурных основах функционирования биополимеров. В первый период становления молекулярной биологии хими­ ческая модификация в ее непосредственном виде широко использовалась для получения сведений о связи функций биополимеров с их структурой. В то же время химические реагенты, действующие на группы определенного типа, модифицируют в той или иной степени все однотипные группы. Поэтому

258_________ Глава 12. Специфические взаимодействия биополимеров____________

в большинстве случаев одновременно с превращением групп, участвующих в функционировании белка или нуклеопротеида, затрагиваются и другие группы того же типа, что в значительной мере обесценивает получаемую информацию.

Например, была исследована модификация фермента фенилаланил-тРНК синтетазой, катализирующей присоединение фенилаланина к тРНК, специ­ фичной для этой аминокислоты, 1,4-пентандионом. Этот реагент при ней­ тральном pH специфично взаимодействует с е-аминогруппами лизина:

Модификация этим реагентом приводит к потере активности фермента. От­ сюда можно сделать вывод, что в структуру активного центра фермента вхо­ дит лизин. Однако оказалось, что для потери ферментом каталитической ак­ тивности на 80 % требуется модификация 25 остатков лизина. Из общих со­ ображений видно, что такое число остатков лизина в формировании активно­ го центра участвовать не может. Какие же именно остатки лизина входят в структуру активного центра, определить из таких данных не представляется возможным. Для получения более определенных химических данных о связи функции со структурой наиболее важное значение приобрели методы, полу­ чившие название аффинной модификации.

Основная идея метода состоит в использовании реагентов, которые наря­ ду с реакционноспособной группой определенной химической специфично­ сти содержат остаток, обладающий специфическим сродством к определен­ ному функционально значимому участку модифицируемого биополимера. Как уже говорилось, способность к высокоселективному взаимодействию

сопределенными партнерами (узнавание партнеров) является важнейшим условием функционирования биополимеров. Оно обеспечивается многото­ чечным нековалентным взаимодействием нескольких групп такого партнера

снабором групп биополимера, имеющих соответствующее расположение на полимере. Как правило, не все группы этого партнера имеют одинаковую значимость для взаимодействия. Поэтому в большинстве случаев удается найти такие остатки, которые можно заменить на реакционноспособную

группу или по которым можно присоединить такую группу, не нарушая в существенной степени способность к узнаванию соединения полимером. Созданный таким образом реагент нековалентно связывается с определенной областью биополимера и направляет реакционноспособную группу в область узнавания. Направленность реакции обеспечивается сродством (аффинно­ стью) реагента, в связи с чем такая модификация получила название аффин­

ной модификации. Так как описываемые подходы, в частности, позволяют ввести по определенному остатку биополимера радиоактивную, флуорес­ центную, спиновую или какую-либо другую метку, то подход часто называ­ ют аффинным мечением (affinity labeling). Реагенты, с помощью которых осуществляется аффинная модификация, обычно называют аффинными реа­ гентами. В типичных случаях аффинные реагенты состоят из двух основных функционально значимых частей - реакционноспособной группы, осуществ­ ляющей модификацию, и фрагмента, обеспечивающего специфичность. По­ следняя направляет химически активную группу, т. е. адресует ее определен­ ной области модифицируемого биополимера. Поэтому эту часть иногда на­ зывают адресом.

Из самого определения понятия аффинной модификации биополимера следует, что модификация применяется к биополимерам, имеющим специ­ фическое сродство к некоторому партнеру. Наиболее типичными объектами применения аффинной модификации являются ферменты, которым свойст­ венно специфичное узнавание субстратов, ингибиторов и эффекторов, и бел­ ковые рецепторы, первичная функция которых сводится к селективному уз­ наванию определенных лигандов, например, гормонов. Аффинная модифи­ кация ферментов, проходящая по их активным центрам, как правило, сопро­ вождается потерей ферментативной активности (инактивацией). Тем самым аффинные реагенты, модифицирующие активный центр фермента, являются необратимыми ингибиторами ферментов.

Описать даже в рамках одной монографии и тем более в рамках учебного пособия весь спектр задач, решенных к настоящему времени методом аф­ финной модификации, а также весь спектр использованных реагентов, не представляется возможным. Поэтому некоторые типичные подходы к конст­ руированию реагентов будут приведены на примере соединений, являющих­ ся реакционноспособными аналогами АТР, одного из веществ, участвующего

вкачестве субстрата в огромном множестве реакций.

Вмолекулу АТР можно вводить реакционноспособные фрагменты по ге­ тероциклу, в особенности по положениям 2 или 8. Примерами таких реаген­ тов, нашедших приложения в аффинной модификации, являются 2-азидо- АТР и 8-азидо-АТР. Можно ввести реакционную группу по рибозному фраг­ менту, либо используя ацилирование по одной из ОН-групп, либо основыва­ ясь на особенностях цис-диольных групп. Эти группы легко образуют цикли­ ческие структуры с карбонильными соединениями, с помощью которых можно вводить химически активные группы. Можно также использовать

сэтой целью описанную в § 2.3 реакцию окисления цис-диольных групп перйодатом, приводящую к образованию двух альдегидных групп. По ним через образование оснований Шиффа и последующее восстановление боргидридом лития или натрия легко ввести по аминогруппам фрагмент, несу­ щий химически активную группу.