1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения

Культура клеток – клетки какой-либо ткани животных или человека, способные расти и размножаться в искусственных условиях.

Культуры клеток широко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин, незаменимы при проведении научных исследований в области вирусологии.

Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения.

Питательные потребности клеток обеспечиваются наличием незаменимых аминокислот (таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови.

Изотоничность и буферность среды поддерживается с помощью неорганических солей. Оптимальным является рН 7,2-7,4, при длительном культивировании клеток значение рН должно оставаться в пределах 6,8-7,8. Постоянство рН в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО₂ (в противном случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону).

Для приготовления питательной среды требуется вода высокой степени очистки, так как культура клеток очень чувствительна к ионам тяжёлых металлов. Рекомендуется применять бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах или очищенную в ионообменных колонках.

Работу с культурами клеток проводят в тщательно обработанной «вирусологической» посуде из специальных сортов стекла или пластиковой посуде из полистерола для одноразового использования.

Приготовленную культуру клеток инкубируют в термостате при температуре 36,0-38,5⁰С.

1.2.2. Типы клеточных культур

Для приготовления культур клеток используют различные ткани животных, человека и птиц как эмбриональные, так и зрелые. Кроме нормальных используют и злокачественные перерождённые ткани, получаемые из опухолей.

Источником эмбриональной ткани часто служит куриный зародыш, а также эмбрионы человека, мышей, свиней, кроликов и др. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются лучшей выживаемостью и более активным ростом, чем ткани взрослого организма. Из зрелых тканей чаще всего употребляется почечная ткань (обезьян, морских свинок, хомячков и др.), амниотическая оболочка человека.

Ткани берут в асептических условиях, промывают в солевом растворе Хенкса и затем подвергают измельчению. В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которые подразделяют на:

1. Культуры фиксированных кусочков тканей.

2. Однослойные культуры клеток:

а) первичные культуры клеток;

б) перевиваемые (стабильные) культуры клеток;

в) культуры диплоидных клеток.

3. Культуры суспензированных клеток.

В практической вирусологии чаще используют однослойные культуры, клетки которых растут и размножаются будучи прикреплёнными к твёрдому субстрату (стеклу, пластику), образуя слой толщиной в одну клетку (монослой). Метод обработки однослойных культур клеток основан на обработке исходной ткани ферментами (обычно трипсином), разрушающими межклеточные связи; ткань диспергируется, и образуется взвесь изолированных клеток. При культивировании клетки прикрепляются к стеклу сосуда и растут в виде сплошного монослоя, благодаря чему удобно воздействовать на клетки, заражая их вирусами, и визуально наблюдать возникающие изменения в динамике.

а) Первичные культуры клеток способны размножаться только в первой генерации

Методика получения первичных культур фибробластов куриного эмбриона

1. Яйца, инкубированные 7-11 дней, овоскопируют. Убедившись в жизнеспособности эмбриона, очерчивают границу воздушного мешка.

2. Скорлупу на тупом конце яйца протирают спиртом, йодом, снова спиртом, а затем срезают на уровне воздушного мешка.

3. Извлекают эмбрион и помещают его в стерильную чашку, удаляют голову. Тело эмбриона омывают 3-5 мл раствора Хенкса, который затем отсасывают.

4. Тело эмбриона тщательно измельчают ножницами, полученные кусочки (размером около 1 мм³) пипеткой переносят в пробирку.

5. Проводят 2-3-кратное отмывание измельчённой ткани от крови. Каждый раз наливают в пробирку с тканью по 2-3 мл раствора, дают ткани осесть, после чего жидкость отсасывают.

6. К отмытой ткани добавляют 3 мл 0,25% раствора трипсина и тщательно перемешивают содержимое пробирки с помощью «пипетирования» (многократного насасывания и выдувания жидкости пипеткой) или энергичного встряхивания. Под действием трипсина клетки ткани разъединяются и образуют суспензию, поэтому после оседания более крупных тканевых частиц на дно пробирки жидкость над осадком должна остаться мутной.

7. Верхний помутневший слой жидкости, содержащий взвесь изолированных клеток, переносят в центрифужную пробирку, куда заранее наливается 2,5 мл питательной среды гидролизата лактальбумина. Проводят центрифугирование при 1 000 об/мин в течение 10-15 минут.

8. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку клеток добавляют 2-3 мл гидролизата лактальбумина и тщательно перемешивают, чтобы клетки вновь оказались во взвешенном состоянии. Для отделения конгломератов клеток, которые могут попасть во взвесь, рекомендуется последующее фильтрование через сетку из нержавеющей стали или марлю.

9. Производится подсчёт клеток в камере Горяева под малым увеличением микроскопа. Определив концентрацию клеток во взвеси, её разводят гидролизатом лактальбумина до 400 000 клеток в 1 мл.

10. Взвесь разливают в пробирки по 1 мл, закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при 37⁰С в наклонном положении под углом 5⁰.

Через 3-4 суток от начала культивирования, просматривая пробирки при малом увеличении микроскопа, можно видеть вытянутые, отростчатые клетки – фибробласты, которые растут на стенке пробирки, образу монослой.

б) Перевиваемые культуры клеток (линии клеток)

Это стабильные культуры клеток, которые способны бесконечно долго размножаться вне организма, если их культивировать в соответствующих условиях. Например, перевиваемые культуры из амниона человека (FL, А-8), почки обезьян (VERO - от зелёной мартышки, LLCMK 2 – от макаки-резус), эмбриона мыши (ЗТЗ), из опухолевых клеток человека (HeLa - из рака шейки матки, Нер–2 – из рака гортани) и многие другие.

Перевиваемые культуры клеток обладают целым рядом преимуществ по сравнению первичными. Работа с ними менее трудоёмка, они отличаются большим диапазоном чувствительности ко многим вирусам. Однако перевиваемые культуры не пригодны для производства вирусных вакцин, так как существуют опасения по поводу их возможной злокачественности.

Перевиваемые культуры клеток без пересева на свежую среду довольно быстро дегенерируют. Поэтому исходную культуру клеток выращивают в матрацах с питательной средой, еженедельно пересевая культуру в новые сосуды. При работе с пробирочными культурами также рекомендуется пересевать их через 7-8 дней, или же раз в 3-4 дня заменять питательную среду свежей, тогда клеточные культуры сохраняют свою жизнеспособность 2-3 недели.

Для культивирования перевиваемых культур клеток применяют среду 199 (часто с добавлением 10% бычьей сыворотки), среду Игла с добавлением 20% сыворотки, 0,5% гидролизат лактальбумина, содержащий 5% телячьй сыворотки.

в) Культуры диплоидных клеток

Их называют полуперевиваемыми культурами, так как ини обладают способностью к пересевам в течение длительного времени – выдерживают до 40-50 пассажей, проводимых на протяжении 8-10 месяцев. Затем культура клеток дегенерирует и гибнет. Диплоидными их называют , потому что они стойко сохраняют диплоидный кариотип, присущий исходным нормальным клеткам организма – родоначальницам диплоидной линии.

Культуры диплоидных клеток получают из различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ (диплоидные клетки лёгких человека), штаммы WJT-38, JMR-90, MRC-5 из лёгких ткани эмбриона человека.

Диплоидные культуры применяют для выделения и культивирования вирусов. Они чувствительны ко многим штаммам вирусов, онкогенно безопасны, пригодны для культивирования в промышленных масштабах и получения массового количества вирусных вакцин.