- •Подготовка материала для окраски
- •Фиксация
- •Физический способ фиксации
- •Химический способ фиксации
- •Процесс окрашивания мазков
- •Микрокапсула
- •Функции капсулы
- •Окраска капсул
- •Окраска по методу Ожешко для выявления спор
- •11. Патогенные простейшие (возбудители амебиаза, токсоплазмоза, малярии). Морфологические особенности возбудителей и вызываемые ими заболевания.
- •12. Вирусы бактерий (бактериофаги)
- •13.Вирусы бактерий-(бактериофаги)
- •14. Морфология плесневых и дрожжеподобных грибов
- •15. Понятия об асептике и антисептике
- •16. Действие физических факторов. Физические методы стерилизации
- •17. Действие химических факторов. Дезинфекция
- •19. Химические и физико-химические методы стерилизации
- •20. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к ним.
- •1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения
- •1.2.2. Типы клеточных культур
- •Культуры суспензированных клеток
- •1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах
- •1.3.1. Строение куриного эмбриона
- •1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку
- •1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных
- •Классификация бактерий по типам дыхания:
- •Культивирование аэробных микроорганизмов
- •Идентификация бактерий по ферментативной активности.
- •28. Понятие об инфекции, инфекционном процессе, инфекционной болезни. Условия возникновения инфекционной болезни.
- •29. Токсины бактерий, их природа и свойства.
- •Патогенность бактерий и её факторы
- •31) Характерные особенности инфекционных заболеваний.
- •32 Виды инфекций -
- •34Классификация инфекций. По происхождению. По локализации. По количеству возбудителей. По течению. Микробоносительство.
- •2)Полиинфекции - смешанные - миксты.
- •3)Реакция нейтрализации.
- •Сложные реакции(состоят из простых).
- •5)Реакции с использованием меченых антител/антигенов
- •41.Антибиотики .Их классификация по химической структуре и спектру действия.
- •42.Принципы химиотерапии инфекционных болезней.Химиотерапевтические препараты и их общая характеристика.
- •43.Понятие о химиотерапии и хтп.Хти
- •44.Антибиотики.Общая характеристика..Историяоткрытия.Классификация по механизму действия.
- •45.Классификация антибиотиков по происхождению и спектру действия.
- •46.Классификация антибиотиков по источнику получения.Способы получения.
- •47.Осложнения при антибиотикотерапии. Их предупреждение.
- •48.Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.
- •1)Диффузионные методы
- •2)Методы разведения
- •49.Сульфаниламиды.Разновидности.Механизм действия.
- •50.Антимикробные химиопрепараты.Нитрофураны, фторхинолоны. Механизм действия.
- •51.Микрофлора тела человека и ее значение.
- •52. Дисмикробиоценоз. Препараты применяемые для лечения.
- •53. Изменчивость бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе бактерий.
- •54,56. Плазмиды бактерий и их значение. Использование плазмид в генной инженерии.
- •55.Виды генетических рекомбинаций у бактерий.
- •57.Использование достижений генной инженерии в получении иммунобиологических препаратов.
- •58.Понятие о биотехнологии. Использование достижений в практической микробиологии.
- •59.Вакцины. Классификация вакцин. Требования предъявляемые к вакцинным препаратам.
- •60. Анатоксины, их получение и практическое применение.
- •61. Диагностикумы (бактериальные, эритроцитарные, вирусные), получение и использование.
- •62. Диагностические сыворотки, получение и использование.
- •64.Инактивированные, корпускулярные вакцины. Приготовление и применение. Достоинства и недостатки.
- •65. Химические (субклеточные вакцины) вакцины. Получение и применение. Роль адъювантов.
- •66.Ассоциированные и комбинированные вакцины. Достоинства.
- •67. Антимикробные сыворотки. Получение и применение.
- •68.Антитоксические сыворотки. Получение, очистка, титрование и применение.
- •69.Иммуноглобулины. Получение и применение.
- •70. Методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.
- •71. Основные принципы микробиологической диагностики вирусных инфекций.
- •72. Серологический метод диагностики инфекционных заболеваний.
- •73. Понятие об иммуномодуляторах. Принцип действия. Применение.
- •74. Стафилококки. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •75. Стрептококки – возбудители гнойно- воспалительных инфекций. Классификация. Свойства. Патогенез вызываемых поражений.
- •76. Стрептококки – возбудители распираторных инфекций. Классификация. Свойства. Патогенез вызываемых поражений.
- •77. Менингококки. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •78. Гонококки. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •79. Эшерихии. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •80. Возбудители брюшного тифа и паратифа. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •82)Сальмонеллы-возбудители пищевых токсикоинфекций. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •83)Лептоспиры. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •84) Возбудитель дифтерии. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •85. Возбудители туберкулеза.Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •86) Холерный вибрион. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •87) Возбудитель урогенитального хламидиоза.Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •88) Возбудитель сибирской язвы. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •89) Возбудитель столбняка. Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •90)Возбудители газовой анаэробной инфекции.Таксономия. Свойства. Патогенез вызываемых поражений. Микробиологическая диагностика. Профилактика и лечение.
- •91. Возбудитель ботулизма- тяжелая, часто фатально заканчивающаяся пищевая токсикоинфекция.
- •97. Возбудитель бруцеллеза-
- •98.Клебсиеллы-
- •99. Синегнойная палочка
- •100. Кишечныйиерсинеоз-инфекционное заболевание, сопровождающееся диареей, узловатой эритемой, артритом.
- •3.Лечение.
- •2.Лабораторная диагностика.
- •112. Аденовирусы.
- •113. Вирус эпидимического паротита.
- •114. Возбудитель ветряной оспы.
- •115. Возбудитель геморрагической лихорадки. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
- •117.Возбудители дерматомикозов (эпидермомикозы).
- •120.Возбудитель токсоплазмоза. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Лечение.
- •Вопрос 121
- •Вопрос 122
- •125. Исследование воздуха аптек
- •126. Исследование посуды, пробок, прокладок
- •127. Исследование воды для приготовления лек средств
- •128.Источники и пути загрязнения лек.Средств.
- •129. Санитарно-показательные микробы почвы и их определение
- •130. Микрофлора почвы. Санитарно-эпидемическое значение . Определение общего колличества микробов в почве.
- •131. Понятие о санитарно – показательных микроорганизмов.
- •132. Способы повышения микробной чистоты нестерильных лекарственных средств.
- •133. Бактериологическое исследование стерильных лек.Средств.
- •134. Санитарно-микробиологическое исследование инвентаря, оборудования, рук и санитарной одежды работников аптек
- •135.Методы контроля микробной загрязненности растительного лек.Сырья
- •136. Санитарно-микробиологическое исследование сухих веществ, используемых для приготовления лек.Форм.
- •138. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха в аптеках.
- •143.При проведении исследования определяют
19. Химические и физико-химические методы стерилизации
Химическую стерилизациюиспользуют при обработке крупногабаритных изделий, приборов, а также аппаратов и термолабильных изделий.
Для газовой («холодной») стерилизацииобычно используют герметичные контейнеры, которые заполняют парами летучих веществ: формальдегида, смесью паров формальдегида и этилового спирта, окисью этилена, смесью окиси этилена и бромистого метила.
Для химической стерилизации растворамиприменяют отечественные (первомур - смесь пергидроля и муравьиной кислоты, перекись водорода, бианол, анолит и др.), импортные препараты (гигасепт, глутаровый альдегид, дюльбак и др.).
Физико – химические методыстерилизации предусматривают совместное использование физических и химических методов стерилизации.
20. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к ним.
Питательной средой называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.
По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86°С, затвердевает при температуре около 40°С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.
По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические.
К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бактерий.
Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или определенной группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона — в щелочной среде и т. д.
Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.
Особую группу составляют синтетические и полусинтетические питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.
Требования, предъявляемые к питательным средам.
Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по возможности прозрачной.
№21. Рост и размножение бактерий. Фазы роста бактериальной культуры.
Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — формированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размножением — самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции. Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования.
Прокариоты обычно размножаются бесполым путем — бинарным делением. В начале деления клетка удлиняется, затем делится нуклеоид. Воспроизведение нуклеоида, содержащего всю генетическую информацию, необходимую для жизнедеятельности микроорганизма,— наиболее важный из всех процессов, которые происходят при росте клетки.
Нуклеоид представлен суперспирализованной и весьма плотно уложенной молекулой ДНК, которая является самореплицирующейся структурой и известна под названием репликона. К репликонам относятся также плазмиды — генетические структуры, способные к самостоятельной репликации. Репликация ДНК осуществляется ферментами ДНК-полимеразами. Этот процесс начинается в определенной точке ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Закапчивается репликация также в определенном месте ДНК - В результате репликации число молекул ДНК в клетке удваивается. Вновь синтезированные молекулы ДНК постепенно расходятся в образующиеся дочерние клетки. Все это позволяет дочерней клетке иметь совершенно тождественную материнской клетке по последовательности нуклеотидов молекулу ДНК - Считают, что репликация ДИК, занимает почти 80% времени, в течение которого осуществляется деление бактериальной клетки.
После завершения репликации ДНК начинается сложный комплекс процессов, которые ведут к образованию межклеточной перегородки. Вначале с обеих сторон клетки происходит врастание двух слоев цитоплазматической мембраны, а затем между ними синтезируется пептидогликан и образуется перегородка, состоящая из двух слоев цитоплазматической мембраны и пептидогликана.
Во время репликации ДНК и образования делящей перегородки клетка микроорганизма непрерывно растет. В этот период происходят синтез пептидогликана клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, образование новых рибосом и других органелл и соединений, которые входят в состав цитоплазмы. На последней стадии деления дочерние клетки отделяются друг от друга. Процесс деления у некоторых бактерий идет не до конца, в результате образуются цепочки клеток.
При делении палочковидных бактерий клетки вначале растут в длину (диаметр клетки не меняется). Когда длина бактерии удваивается, палочка несколько сужается в середине и затем распадается на две клетки. Чаще всего клетка делится на две равные части (изоморфное деление), однако встречается и неравномерное (гетероморфное) деление, когда дочерняя клетка больше материнской.
Спирохеты, риккетсии, некоторые дрожжи и грибы, простейшие и другие организмы размножаются поперечным делением клеток.
Миксобактерии делятся перетяжкой. Сначала клетка в месте деления слегка суживается, далее клеточная стенка, постепенно впячиваясь с обеих сторон внутрь клетки, все больше и больше сужает ее и, наконец, делит на две. Дочерняя клетка, одетая уже собственной цитоплазматической мембраной, еще временно сохраняет общую клеточную стенку.
У бактерий иногда наблюдается «половой» процесс, или конъюгация
У других бактерий кроме размножениянаблюдаетсяполовой процесс, но в самой примитивной форме. Половой процесс бактерий отличается от полового процессаэукариоттем, что у бактерий не образуютсягаметыи не происходит слияния клеток. Однако главнейшее событие полового процесса, а именно обмен генетическим материалом, происходит и в этом случае. Этот называется генетической рекомбинацией. ЧастьДНК(очень редко вся ДНК) клетки-донора переносится в клетку-реципиент, ДНК которой генетически отличается от ДНК донора. При этом перенесённая ДНК замещает часть ДНК реципиента. В процессе замещения ДНК участвуютферменты, расщепляющие и вновь соединяющие цепи ДНК. При этом образуется ДНК, которая содержит гены обеих родительских клеток. Такую ДНК называют рекомбинантной. У потомства или рекомбинантов, наблюдается заметное разнообразие признаков, вызванное смещением генов. Такое разнообразие признаков очень важно для эволюции и является главным преимуществом полового процесса.
Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки. Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида. Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация. Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура — непрерывной. При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. .
1) Рост бактерий с равномерным помутнением среды.
2. Придонный рост бактерий, характеризующийся образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой.
3. Пристеночный рост бактерий, выражающийся в образовании рыхлых хлопьев, прикрепленных к внутренней поверхности стенок сосуда.
4. Поверхностный рост бактерий, характеризующийся появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки. Рост на полужидкой питательной среде характеризуется помутнением всей толщи среды или образованием сосульки цилиндрической или конической формы.
Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов: 1. лаг-фаза; 2. фаза логарифмического роста; 3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий; 4. фаза гибели бактерий. Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кривой размножения бактерий, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени их культивирования. Лаг-фаза — период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования. Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.
Размножение бактерий на плотной питательной среде.
Рост микробов на плотной питательной среде. Для изучения свойств колоний микробы культивируют на плотных питательных средах в чашках Петри. При этом посев материала проводят таким образом, чтобы получить изолированные колонии. Для характеристики колоний используют следующие признаки:
1. Размер колонии. Колонии обычно измеряют в миллиметрах или пользуются для этого описательными терминами, такими, например, как точечные (диаметр менее 1 мм), мелкие (диаметр 1-2 мм), средние (диаметр 2-4 мм) и крупные (диаметр 4-6 мм и более).
2. Форма колонии. Бывает правильной (круглая), неправильной (амебовидная), ризоидной (корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев).
3. Контуры края. Определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные края (фестончатый, волнистый, эрозированный или зазубренный, бахромчатый).
4. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и формой на вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или при помощи лупы при рассматривании сверху и сбоку. Различают каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы, плоско-выпуклые колонии, конусообразные колонии, колонии с приподнятой серединой, колонии с вдавленным центром, плоские колонии.
5. Поверхность колонии. Изучают при помощи лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность колонии бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth - гладкий), шероховатые - буквой R (rough - шероховатый).
6. Цвет колонии. Определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.
7. Структура колоний. Определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженной диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. По структуре различают гиалиновые колонии, зернистые колонии, нитевидные или волокнистые колонии.
8. Консистенция колоний. Исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериологической петлей. По характеру консистенции колонии бывают пастообразные, вязкие или слизистые, волокнистые или кожистые, хрупкие сухие.
Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий. Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают её. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. И, наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях. Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксиддисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиотикоподобным действием.
№22. Особенности культивирования риккетсий, хламидий и вирусов.
Риккетсии и хламидии — облигатные внутриклеточные бактерии, которые не растут на искусственных питательных средах. Вирусы также являются облигатными внутриклеточными микроорганизмами, но они принципиально отличаются от всех внеклеточных и внутриклеточных бактерий; отсутствием клеточной организации, ферментов строительного и энергетического метаболизма, наличием одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), неспособностью к бинарному делению. Для культивирования риккетсии, хламидий и вирусов используют клеточные культуры, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных.
Клеточные культуры. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Переви-виваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с дабавлением телячьей сыворотки крови.
Клетки эпителиальной и соединительной тканей растут в суспензии; при оседании они довольно прочно прикрепляются
к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде "пласте, состоящего из одного слоя клеток (монослоя).
Перевиваемые однослойные клеточные культуры приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки, а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил асептики во избежание заноса в них различных микроорганизмов из окружающей среды.
''После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток, которая начинает расти и развиваться, ее заражают материалом, содержащим риккетсии, хламидии или вирусы. Упомянутые микроорганизмы проникают внутрь клеток, где и размножаются:
В клетках, пораженных риккетсиями, на 3—8-й день отмечается большое количество коккобациллярных форм, заполняющих целиком цитоплазму или ядро клеток, которые затем гибнут.
'Хламидии также рассматривают в окрашенных по Романовскому—Гимзе препаратах клеток^в которых наблюдают различные формы размножающихся микроорганизмов.
размножение (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток. При этом часть из них погибает и отслаивается от стенки пробирки^Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие клетки, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплошного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточные островки.
'Характер ЦПД, вызванный разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних (парамиксовирусы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других к (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация клеток и т.д. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая клеточную
культуру под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом) Некоторые вирусы (энтерови-русы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4—6-й день). Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
Другой метод — реакция гемагглютинации. Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости клеточной культуры либо хорион-аллантоисной или амниоти-ческой жидкости куриного эмбриона. Гемагтлютинацию— скучивание эритроцитов кур, гусей, морских свинок —вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин."
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с клеточными культурами и подопытными животными значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Для получения чистых культур риккетсии, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют куриные эмбрионы в возрасте от 8 до 12 дней. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, которые обнаруживают после вскрытия эмбриона на его оболочках. О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами
К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроба без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсии или вирусов при изготовлении различных препаратов.
Лабораторные животные. Экспериментальные животные используются для выделения риккетсий и вирусов из исследуемого материала, а также для получения больших количеств этих микроорганизмов. Например, риккетсий можно культивировать в легких мышей и кроликов, производя заражение животных через нос. При этом способе культивирования получают большое количество материала и используют его для приготовления вакцин или диагностических препаратов. Успех выделения вируса зависит от правильного выбора вида экспериментального животного и способа введения материала. Для выделения, нейровирусов наилучшим является введение исследуемого материала в головной или спинной мозг, респираторных вирусов — на слизистую оболочку верхних дыхательных путей. Для лабораторных целей используют белых мышей, кроликов, белых и хлопковых крыс, морских свинок, обезьян. Наиболее широко применяют в вирусологической практике белых мышей, например для выделения вирусов — возбудителей бешенства, энцефалита, орнитоза. После введения исследуемого материала за животным устанавливают наблюдение, отмечают его поведение, появление симптомов заболевания, температуру. Если у первично зараженного животного отсутствуют клинические проявления болезни, производят 2—3 последовательных «слепых пассажа» на новой партии животных, вводя им суспензии из органов животных первой партии. При отсутствии симптомов заболевания у повторно зараженных животных результаты исследования считают отрицательными. При наличии у животных клинических признаков болезни производят определение вирусов в суспензии органов с помощью серологических реакций (реакция нейтрализации с известными сыворотками).
Для бактериологического исследования берут стерильно кровь из сердца, кусочки органов для посева на питательные среды, готовят мазки-отпечатки для окраски и микроскопирования.
Применяют подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, субдуральный и другие методы заражения лабораторных животных.
№23. Культивирование вирусов. Методы индикации и идентификации вирусов в культуре клеток.