Глава 1 методы изучения ангиогенеза

Длительное время основными методами изучения ангиогенеза были различные экспериментальные модели. Исследователи пред­полагали так или иначе воздействовать на организм с целью по­следующего анализа возникающих явлений. Это привело к тому, что буквально до самого последнего времени проблема нормально­го роста и развития кровеносных капилляров решалась только на основе данных экспериментального воздействия на окружающие ткани.

При изучении новообразования кровеносных сосудов сегодня используются все методы, применяемые при исследовании реге­нерации органов и тканей, - рутинные анатомические и гистоло­гические, современные гистоавторадиографические и электронномикроскопические. Стала широко привлекаться скани­рующая электронная микроскопия, в том числе с использованием коррозионных анатомических препаратов. Данный метод позволя­ет осуществить трехмерную реконструкцию растущих сосудов и сосудистых «почек» (83). Сканирующая электронная микроскопия была использована для демонстрации регенерации эндотелия по­сле повреждения сосудов (335). Просвечивающая электронная микроскопия с применением стереологических принципов стала обычной в практике исследования процессов ангиогенеза (446). Одним из удачных оказался метод тонического анализа, использо­ванный для изучения морфологической организации и проницае­мости стенок различных сегментов новообразованных капилляров (7). Успешно применяется высоковольтная электронная микро­скопия (192). Многообещающим является использование конфо­кальной микроскопии с лазерным источником света, позволяющим делать как бы последовательные «срезы» целостного образца (96).

Наконец, все шире в изучение ангиогенеза внедряется морфометрия, хотя принципиальные подходы к морфометрическому анализу процессов васкуляризации развиты довольно слабо. Обычным в практике изучения ангиогенеза стало применение иммуноморфологических методов идентификации различных клеток сосудистой стенки и окружающих тканей, разнообразных белков и белоксодержащих молекул в окружающем интерстициальном матриксе и на подлежащем субстрате (444). Использование анализа­торов изображения позволяет количественно оценивать процессы ангиогенеза (182).

Наиболее старыми феноменами, используемыми для исследо­вания неоангиогенеза, являются процессы роста и созревания гра­нуляционной ткани. Новообразование сосудов изучают с помощью морфологического исследования органов после повышения функ­циональной нагрузки, а также их трансплантации (подробнее см.7).

Длительное время основными экспериментальными моделями для исследования ангиогенеза были следующие: наблюдение за ростом сосудов на различных тонких органах или структурах ни­зших животных или на развивающемся зародыше птиц; имплан­тация прозрачной камеры; исследование ангиогенеза на бессосудистых структурах, например, роговице; анализ изменений роста сосудов на хориоаллантоисной мембране, на вителлиновой (vitelline) мембране; изучение васкуляризации трансплантатов ор­ганов и тканей, в том числе в диффузионных (то есть заключен­ных в полупроницаемую мембрану) камерах; исследование перестройки сосудов в musculus craemaster, сосудистой оболочке глаза; тканевые культуры, то есть выращивание клеток сосудистой стенки на различных подложках; наблюдение за ростом сосудов в хвосте головастика, в брыжейке молодых крыс и т.д.

Наконец, обнаружение ангиогенных свойств опухолевых клеток и выделение из них и ряда других субстратов веществ, являющих­ся индукторами ангиогенеза, то есть факторами, вызывающими рост новых сосудов, дало возможность моделировать процессы но­вообразования сосудов в наиболее чистом виде (7) или других ла­бораторных животных.

Большинство используемых моделей предназначено для реше­ния вопроса, имеет место в данный момент новообразование сосу­дов или нет. По мнению O.Hudlika (194), о наличии ангиогенеза можно судить: по повышению митотической активности эндотелия микрососудов, по появлению капиллярных ростков – “почек” и по изменению плотности расположения капилляров в изучаемом органе. Помимо указанных прямых признаков можно использо­вать косвенные: локальный лизис базальной мембраны эндотелия стенки предсуществующего сосуда с появлением цитоплазматических отростков на базальной поверхности эндотелиоцитов, неза­вершенность дифференцировки последних и др. Эти признаки в отдельности неспецифичны для неоангиогенеза, поскольку встре­чаются и при других состояниях, однако их совокупность служит доказательством наличия новообразованных сосудов.

Для изучения ангиогенеза используется введение тестируемой субстанции в переднюю камеру глаза, в дорзальный воздушный мешок (после инъекции воздуха под кожу), в сальник и другие производные брюшины, в желточный мешок куриного эмбриона. Тестируемый кусочек может быть заключен в фибрин, желатин или другие матриксы. Определение клиэренса ксенона применяет­ся для функциональной оценки вновь образованных кровеносных сосудов. До сих пор не утратил своего значения метод интрадермального анализа ангиогенеза.

Несмотря на интенсивное развитие новых моделей ангиогенеза и методов исследования большинство ученых считают, что надеж­нее и лучше всего использовать несколько тест-систем.

Остановимся несколько подробнее на основных способах изуче­ния ангиогенеза, используемых в настоящее время.