6. Принципы структурно-функциональной организации белков. Методы изучения структуры белков.

Белки – сложные полимеры био происхождения сост из АК остатков соедин пепт связями.

Принято выделять четыре уровня структурной организации белков: первичная, вторичная, третичная и четвертичная. Первичная структура - последовательность соединения аминокислот в полипептидной цепи, составляющих молекулу белка. Вторичн. стр-ра белков – упорядоченное свертывание полипепт цепи в спираль. Трет структ – укладка полипепт цепей в глобулы, возникающ в рез-те возник хим св и установления гидрофоб взаимод м/у радикалами остатков. Четверт – хар-на для сложных белков, молекулы котор образ двумя и более глобулами (инсулин).

Методы изучения структуры белков.

Первичная:

• полный гидролиз (щелочной, кислотный и ферментативный)

• идентификация аминокислот (аминокислотный анализатор, хроматография, цветные реакции)

• определение N – концевой аминокислоты (метод Эдмана Сенгера, использование аминопептидазы).

• определение С – концевой аминокислоты (гидразиновый метод, использование карбоксипептидазы).

• расщепление белка на небольшие пептиды.

• установление концевых аминокислот и последовательности в пептидах (использование секвенатора).

• сопастовление аминокислотной последовательности в перекрывающихся пептидах.

Вторичная:

• Спектрополяриметрия

• Методы изотопного обмена

• УФ спектрофотомерия

• ИК спектроскопия

Третичная:

• Электронная микроскопия

• Рентгеноструктурный анализ

Четвертичная:

• Электронная микроскопия

• Рентгеноструктурный анализ

• Электрофорез

7. Первичная структура белков. Гидролиз белков, определение аминокислотного состава. Анализ n- и с-концевых аминокислот.

Первичная структура - последовательность соединения аминокислот в полипептидной цепи, составляющих молекулу белка. Для опред структ молекулы белка состоящ из неск полипептидн цепей необходимо разъед-ть эти цепи и связи.

Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков.многие генетические болезни - результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания.

Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:

• определение аминокислотного состава изучаемого белка;

• аминокислотной последовательности в белке.

Кислотный гидролиз белка

Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты.

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии

Смесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой.

Количественный анализ полученных фракций.

нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты.

Гидролиз – распад сложного вещества на более простые составные части, связанный с присоединением воды по месту разрыва связей. В зависимости от применяемого катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются только аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе, как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.

При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин – частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов.

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

Для определения природы N-концевой аминокислоты предложен ряд методов, в частности метод Сэнджера , основанный на реакции арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом(ДНФБ), что приводит к образованию окрашенного в желтый цвет 2,4-динитрофенильного производного N-концевой аминокислоты . Раствор полипептида обрабатывают ДНФБ, который взаимодействует со свободной NH2-группой N-концевой аминокислоты пептида.