МОДУЛЬ 3. Молекулярна біологія. Біохімія фізіологічних функцій

Змістовий модуль 12. Метаболізм амінокислот. Ензимопатії амінокислотного обміну

Тема заняття № 1. Дослідження перетравлення та всмоктування амінокислот. Загальні шляхи перетворення амінокислот у тканинах.

Мета заняття:

• Трактувати біохімічні функції амінокислот в організмі: використання в якості попередників у біосинтезі біологічно активних сполучень, біосинтез білків, розпад амінокислот до кінцевих продуктів.

• Розглянути основні шляхи обміну амінокислот у тканинах.

• Проаналізувати та виконати процес трансамінування в експерименті.

Теоретичні питання.

1. Основні шляхи обміну амінокислот у тканинах

1. Трансамінування амінокислот в організмі людини

• Механізм дії амінотрансфераз. Коферментні форми вітаміну В₆.

• Біохімічне значення реакцій трансамінування.

• Визначення активності аланін- та аспартатамінотрансфераз з діагностичною метою.

3. Дезамінування амінокислот.

• Механізм окисного дезамінування, ферментативний та неферментативний етапи реакції, коферментна форма вітаміну РР.

• Непряме дезамінування амінокислот.

4. Декарбоксилування амінокислот.

• Декарбоксилази амінокислот, кофермент декарбоксилаз.

• Значення декарбоксилювання амінокислот на прикладі утворення фізіологічно активних сполучень: біогенних амінів, гормонів, медіаторів

• Декарбоксилування амінокислот у процесі гниття білків у кишківнику.

Практичні роботи.

Завдання 1. Здійснити в експерименті процес трансамінування, використовуючи глутамінову та піровиноградну кислоту (контроль утворення кінцевих продуктів за допомогою методу паперової хроматографії).

Принцип методу. У процесі ферментативного переносу аміногрупи з глутамінової кислоти на кетокислоту (ПВК) утворюється аланін, який визначають хроматографічно.

Хід роботи: у дві пробірки відміряють по 0,5 мл розчину глутамінової кислоти, 0,5 мл розчину ПВК, 1 мл розчину вуглекислого калію та 0,25 мл розчину монобромоцтової кислоти.

В 1 пробірку (дослід) додають 0,5 мл свіжої м’язової кашки, у другу пробірку - м’язову кашку, яка попередньо прокип’ячена протягом 1-2 хвилин. Обидві пробірки ставлять у термостат при t =37^оС на 15 хвилин. Потім у кожну додають по 0,25 мл оцтової кислоти та кип’ятять 2-3 хвилини до повного осадження білків. Вміст пробірок фільтрують. Фільтрати хроматографують. З цією метою на лінії старту двох смужок фільтровального паперу (дослід та контроль) наносять по краплині фільтратів з пробірок, кожного разу підсушуючи на повітрі. Смужки паперу опускають у пробірки, на дні яких знаходиться фенол, насичений водою. Пробірки у штативі поміщають до термостату на 1 годину при 35-40^оС. Після цього смужки паперу виймають, відмічають лінію фронту (фініш) розчинника, підсушують 10-15 хвилин при 100^оС, а потім проявляють розчином нінгідрину. Знову підсушують.

Для кожної виявленої плями обчислюють коефіцієнт Rf за формулою:

Rf = 1/h

1 - це відстань від старту до центру плями,

h - відстань від старту до фінішу ( відстань, яку пройшов розчинник).

На основі одержаних даних роблять висновки, хроматограму підклеюють до протоколу.

Rf амінокислот:

Глутамінова кислота 0,16

Аланін 0,55

Цистеін 0,19

Метіонін 0,39

Тирозін 0,52

Фенілаланін 0,78

Завдання 2. Визначення активності амінотрансфераз.

Принцип методу. Амінотрансферази – ферменті які містять у якості коферментів фосфопіридоксамін, каталізують оборотний перенос аміногруп з амінокислот на α – кетокислоти. Визначення концентрації α – кетокислот, які утворюються при трансамінуванні лежить в основі дінітрофенілгідразинового методу визначення активності трансаміназ.

Хід роботи. Визначення активності аспартатамінотрансферази (АсАТ). В пробірку вносять 0,5 мл субстратно-буферної суміші для визначення АсАТ (субстратом є аспарагінова кислота і α-кетоглутарова кислота), витримують у термостаті при t =37^оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37^оС 60 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідразину та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин.

Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються, при

λ = 560нм.

Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ). В пробірку вносять 0,5 мл субстратно-буферної суміші для визначення АлАТ (субстратом є аланін і α-кетоглутарова кислота), витримують у термостаті при t =37^оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37^оС 30 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідразину та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин. Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються. Контрольні проби обробляють так само, як дослідні, але сироватку додають після інкубації проб.

Розрахунок активності ферментів проводять по калібрувальному графіку. При будові калібрувального графіку на осі ординат відкладають значення оптичної щільності, а на осі абсцис вміст ПВК в мкмоль.

Фізіологічні рівні: для АсАТ – 0,1-0,5, для АлАТ – 0,1-0,7 мкмоль ПВК на 1 мл сироватки за 1 годину інкубації при t =37^оС.

Клініко-діагностичне та практичне значення. Визначення активності амінотрансфераз у сироватці крові має важливе значення для діагностики захворювання серця та диференціальної діагностики хвороб печінки. У початкові періоди інфаркту міокарду через 4-6 годин спостерігається підвищення активності АсАТ, через 24-36 годин воно чітко виражено і лише на 3-7 день активність ферменту знижується до норми, зміни АлАТ при цьому незначні.

Активність обох амінотрансфераз, особливо АлАТ, збільшується при інфекційному гепатиті. Особливе значення для діагностики має збільшення активності АлАТ при безжовтяничних формах хвороби Боткіна. Із збільшенням термінів захворювання активність амінотрансферази поступово знижується. У дітей спостерігається більш рання нормалізація. У випадку затяжного перебігу захворювання проявляється довготривала гіперферментемія, при рецидивах та загостренні активність амінотрансфераз знову збільшується. При токсичній формі гепатиту та загостренні хронічного гепатиту часто спостерігаються значні цифри ферментативної активності.