71 Индикация вирусов в зараженных культурах клеток.

Результаты взаимодействия вируса с культурой клеток

1. По типу острой инфекции (вирулентной). Вирус адсорбируется на клетке, проникает в неё, активно репродуцируется, клетка разрушается, вирус входит за пределы клетки. В культуры клеток наблюдается ЦПД (цитопатогенное действие). ЦПД проявляется в виде округления, вакуолизации, образования гигантских клеток-симпластов;

2. По типу хронической инфекции (латентной). Вирус проникает в клетку, репродуцируется, медленно выходит за пределы клетки. Клетка не разрушается, внешних изменений не наблюдается;

3. По типу опухолевой трансформации. В культуре клеток появляются микроопухоли, очаги многослойного роста. Вирус проникает в клетку, происходит интеграция геномов вируса и клетки с помощью фермента обратной транскриптазы, она превращается в опухолевую, начинает делиться…

72 Методика титрования вирусов по единичному эффекту.

Титрование вирусов по единичному эффекту

1. Готовят ряд последовательных 10тикратных разведений из исходного ВСМ.

2. Начиная с последнего (максимального) разведения заражают по 4 куриных эмбриона или культуры клеток. В случае гибели подсчитывают количество оспин (бляшек). В первых разведениях будет слишком много оспин, их не подсчитать, поэтому берут разведение 10^-4, где видны отдельные оспины.

В 1м – 10, во 2м – 12, в 3м – 10, в 4м – 12 (к примеру)

Подсчитывают среднее арифметическое = 11.

3. Титр определяют по формуле:

Т = титр (ООЕ)

n – среднее арифметическое количества оспин в 1 эмбрионе (11)

V – объем ВСМ (0,2 мл)

а – степень разведения вируссодержащего материала, в котором подсчитали количество оспин (1/10000)

Т = 11*10000/0,2 = 550000 ООЕ/см³

Метод имеет ограниченное применение, потому что очень мало вирусов вызывают локальные поражения биологических моделей.

У большинства вирусов определяют титр в LD₅₀.

73 Определение титра вируса. Методика расчета лд50 по Риду и Менчу.

Определение титра вируса в LD₅₀ по способу Рида, Менча

1. Готовят ряд последовательных 10тикратных разведений, начиная с максимального разведения заражают по 4 биологических модели каждым разведением.

2. Абсолютные данные о гибели зараженных эмбрионов заносят в протокол.

3. Определяют кумулятивные данные (накопительные). При подсчете кумулятивных данных количества выживших эмбрионов суммируют вышестоящую цифру с нижестоящей, начиная с маленькой. Считают, что если эмбрион выжил при введении большей дозы, то выживет и при введении меньшей дозы. При подсчете кумулятивных данных количества павших эмбрионов суммируют нижестоящую цифру с вышестоящей. Считают, что если эмбрион погиб при введении меньшей дозы, то он погибнет и при введении большей дозы.

4. Определяют % летальности: кумулятивное количество Павших * 100 / (кумулятивное количество павших + кумулятивное количество выживших)

5. Определяют коэффициент пропорциональности.

10^-8 – высшая критическая доза, летальность = 54% (ВКД)

10^-9 – низшая критическая доза, летальность = 29% (НКД)

КП = (% летальности ВКД -50) / (% летальности ВКД - % летальности при НКД) = (54-50)/(54-29) = 0,16

Т = ВКД – КП = 10^{-8 – 0,16}= 10^-8,16 = LD₅₀/0,2 см³

8 – характеристика, показывает, сколькизначным будет конечный результат (+1)

16 – мантисса. С помощью мантиссы по таблице антилогарифмов находят число (1445)

1:144500000 LD⁵⁰/0,2см³

1 LD₅₀ = 1:144500000 в 0.2 см³

10 LD₅₀ = 1:14450000 в 0,2 см³

100 LD₅₀ = 1:1445000 в 0,2 см³

1000 LD₅₀ = 1:144500 в 0,2 см³

Чтобы приготовить такое разведение, готовят сначала 10тикратные разведения (7 пробирок)

0.5 вируса, 4,5 физраствора – как обычно, из последней берут 1 мл жидкости и добавляют 13,45 мл воды. Чтобы получить меньшее разведение – уменьшают количество пробирок (не 7, а 6).

Титрование вирусов необходимо проводить при постановке серологических реакций, например, реакции нейтрализации, а также при получении биологических иммунных препаратов.