22 Виды культур клеток и их использование. Переживающие и плазменные культуры.

Переживающие клеточные культуры

Один из самых простых и старых способов. Его в основном используют для получения противовирусных вакцин. Используют эпителиальные ткани с языков КРС (только что убитых животных). Языки натягивают на барабан, обрабатывают антисептиком и снимают эпителий в виде стружки (20г). Полученный эпителий помещают в раствор Тироде, в него добавляют антибиотики и доставляют на биофабрику. Далее эти кусочки помещают в среду Френкеля и вносят вирус ящура. Он активно накапливается в клетках эпителия и репродуцируется. Всю эту ткань гомогенизируют и используют для получения вакцин.

Плазменные культуры

Более старый метод. Это метод культивирования кусочков ткани, фиксированный в плазме. Для этого метода используют любе ткани. Их измельчают, промывают буферным раствором и помещают в матрасы, пробирки, чашки Карреля. Кладут по 5-10 кусочков на расстоянии 0,5-1 см друг от друга. Затем кусочки фиксируют куриной плазмой – 1 капля на 1 кусочек. После свертывания плазмы добавляют питательную среду и помещают в термостат при 37-38градусах Цельсия. Через 24 часа вокруг кусочков будут выросты, состоящие из тонких темных клеток.

Органные культуры

Культивирование кусочков органов эмбрионов или взрослых животных (легкие, трахея, печень, почки, тимус). При этом методе сохраняются взаимоотношения между разными видами клеток. Выращивание органных культур проводят на поверхности питательной среды. После заражения этих культур делают гистосрезы и изучают действие вируса на клетки. Культуры предусмотрены для диагностических целей – отбирают культуры с хорошим монослоем, заражают вирусом и изучают взаимодействие вируса с культурой клеток.

23 Первично-трипсинизированные культуры клеток и субкультуры, их использование.

Первичные культуры клеток

Используются в основном для диагностических целей, получают их чаще всего из эмбриональных тканей (лабораторное занятие). Они могут жить в течение месяца. Чтобы продлить жизнь первичных культур и получить более стандартные, из них получают:

Субкультуры

Из сформировавшегося монослоя получают вторичную культуру. Для этого из флакона удаляют питательную среду и вводят раствор Версена (0,02%). Под действием раствора клетки отделяются от стекла. Флаконы встряхивают и центрифугируют (1000 оборотов, 10-15 минут). Надосадочную жидкость удаляют, добавляют свежую питательную среду, рассчитывают и готовят рабочую взвесь и засевают в новые флаконы или пробирки (100-150тыс.кл. на 1 кубик). Субкультура вырастает за 3-4 дня после посева. Клетки субкультуры более однородные, обладают одинаковой чувствительностью к вирусу и более чувствительны, чем первичные культуры. Живут до 4 недель.

24 Перевиваемые и диплоидные культуры клеток, их использование.

Перевиваемые культуры

Постоянные. Было замечено, что в стареющих первичных культурах обнаруживаются быстро растущие клетки нового типа. Это перевиваемые клетки. Они могут длительное время размножаться вне организма. В 1914 году Каррель впервые получил эту культуру из клеток сердца куриного эмбриона. Вначале перевиваемые клеточные культуры получали из нормальных клеток, но потом заметили, что они превращаются в злокачественные, и в последние годы стали использовать опухолевые клетки.

В 1952 году ученый Гей впервые получил чувствительную линию клеток Hela из раковой опухоли шейки матки женщины. Были получены линии перевиваемых клеток Детройт, ВНК, СЭП (свиная эмбриональная почка), СПЭВ. Преимущества этого метода: клетки можно перевивать бесконечно, в лаборатории можно иметь постоянную культуру клеток, они стандартные. Недостаток в том, что если использовать перевиваемые клетки для получения живых вакцин – они дают в организме опухолевый рост.

Диплоидные культуры

Полуперевиваемые. У перевиваемых клеток гаплоидный набор хромосом, у диплоидных клеточных культур сохраняется двойной. Получение основано на использовании компонентов питательных сред и солевых растворов высокой степени очистки. При работе с диплоидными клеточными культурами используют щадящие методы воздействия на ткань, т.к. они не обладают биологическим бессмертием, через 50-80 пассажей они погибают. В настоящее время их получают из легких, кожно-мышечной ткани, почек.