62 Общие принципы и современные методы диагностики вирусных болезней.

Главная цель диагностики – распознать заболевание и определить возбудителя болезни. Правильный (точный) диагноз позволяет грамотно провести профилактические и терапевтические мероприятия и мероприятия по борьбе с этой болезнью.

Диагноз на вирусные заболевания ставят с учетом эпизоотической ситуации (эпизоотологических данных), всегда учитывается клиническая картина, патологоанатомические изменения. На основании всего этого можно поставить только предварительный диагноз. Окончательный диагноз можно поставить только на основании лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика очень трудная, так как проводится практически вслепую.

Диагностика – сбор материалов, позволяющих определить болезнь, кропотливая и тщательная работа.

63 Подготовка патологического материала для вирусологических исследований.

Цель – максимально извлечь вирус из клеток, так как они являются строгими внутриклеточными паразитами.

1. Извлекают патматериал, если он законсервирован глицерином – ополаскивают в 3х порциях стерильной воды;

2. Отрезают кусочек ткани и готовят мазки-отпечатки для микроскопических исследований;

3. Отрезают кусочек ткани примерно 1г, измельчают его ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Иногда используют специальные гомогенизаторы.

4. К растертой массе добавляют физраствор в соотношении 1:10 (10 кубиков)

5. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 оборотов в минуту 5-10 минут.

6. Надосадочную жидкость переносят в стерильную посуду. При необходимости суспензию дважды замораживают и размораживают. Иногда используют жирорастворители для очистки вируса. Чаще всего используют хлороформ. Полученную суспензию обрабатывают антибиотиками, выдерживают 30 минут (или путем фильтрации через бактериальный фильтр)

7. Ставится контроль на бактериальную загрязненность – путем посева, например, на МПБ и МПА.

8. Полученную суспензию делят на 2 части, одну часть используют для заражения биологических моделей, вторую часть хранят в холодильнике, в морозильной камере.

64 Индикация вирусов в патологическом материале путем обнаружения вирионов и вирусных телец – включений.

Световую микроскопию в вирусологической практике используют с двоякой целью:

1. Для обнаружения (вирусоскопии) вирионов крупных вирусов;

2. Для обнаружения вирусных внутриклеточных телец-включений.

Вирусоскопия

Вирион – зрелая сформированная вирусная частица, как правило, находящаяся вне клетки. Размеры вирионах некоторых крупных вирусов находятся на границе разрешающей способности светового микроскопа – 0,2 мкм. Размеры вирионов некоторых вирусов находятся в пределах 250-300нм. При специальном методе окраски по методу Морозова можно увидеть эти вирионы. Самыми крупными являются вирусы, относящиеся к семейству поксвирусы (оспенные вирусы). Вирионы остальных вирусов вообще не видны в световой микроскоп.

Методика окраски по Морозову

1. Мазок высушивают

2. Погружают в дистиллированную воду

3. Наливают жидкость руге (100 мл дистиллированной. воды, 1 мл ледяного уксуса, 2 мл 40% формальдегида) 1 мин

4. Промывают

5. Наливают протраву (100 мл дистиллированной воды, 5г танина, 1 мл жидкого фенола) 1-2 мин

6. Подогревают до появления паров

7. Промывают дистиллированной водой

8. Наносят импрегнирующий раствор азотнокислого серебра и подогревают до появления темно-коричневого цвета. (100 мл дистиллированной воды, 5г ляписа, 25% аммиак до опалесценции)

9. Промывают, высушивают, микроскопируют

Вирионы темно-коричневого или черного цвета. Обнаружение вирионов оспенных вирусов имеет диагностическое значение при исследовании материала на оспу животных и птиц, а также при диагностике эктимы овец (инфекционный пустулезный дерматит).

Обнаружение вирусных внутриклеточных телец-включений

Тельца-включения представляют собой скопление компонентов вирусных частиц в клетках, пораженных вирусом. Эти компоненты образуются в результате репродукции вируса (размножения) и представляют собой НК и белки вирусов. Тельца-включения обнаруживаются как в цитоплазме клеток, чаще у РНКовых вирусов, так и в ядре клеток (чаще у ДНКовых вирусов). Количество их может находиться в пределах от 1 до 12 штук. Морфологически они отличаются от других клеточных структур. Размеры их могут быть больше даже размеров ядра клетки: 1-30 мкм. Тельца-включения некоторых вирусов имеют специальные названия в честь ученых, которые их открыли. Наибольшее практическое значение имеют тельца -включения при бешенстве тельца-включения Бабеша-Негри). При болезни Борна образуются тельца Дегена и Оста. При инфекционном гепатите плотоядных (ИГП) – тельца Рубарта. При оспе человека – тельца Гварниери. При оспе птиц – тельца Боллингера.

Тельца по-разному воспринимают краски. Одни – базофильные, другие – эозинофильные. Существуют универсальные и специальные методы окраски телец-включений. К числу универсальных методов окраски телец-включений окрасится окраска по Романовскому-Гимзе.

Методика окраски по Романовскому-Гимзе

Фиксируют спирт-эфиром или метиловым спиртом. На приготовленный и зафиксированный препарат наносят краску путем «подслаивания» под препарат. Для этого препарат помещают в чашку Петри на спички мазком вниз. Краску Романовского-Гимзе предварительно разводят водой из расчета 1 каплю краски на 2 кубика дистиллированной воды. Время экспозиции – 30-60 минут, лучше – в условиях термостата. Промывают, высушивают, микроскопируют в иммерсионной системе. Тельца-включения РКНковых вирусов окрашиваются в красный цвет, ДНКовых – в фиолетовый. Можно использовать для обнаружения любых телец-включений.

Методика окраски по Муромцеву

На бешенство. Является примером специальных методов окраски.

Цитоплазма голубая, ядро синее, эритроциты красные, тельца-включения красно-фиолетовые.

1. Растирают кусочек аммонова рога.

2. Готовят мазки

3. Фиксируют метиловым спиртом или спирт-эфиром 2 часа

4. Ополаскивают дистиллированной водой

5. Погружают в синьку Мансона /1:10

6. Выдерживают в 10% растворе танина до появления голубого оттенка

7. Высушивают

8. Погружают в спирт или смесь спирта с ацетоном /1:1/ 3-5 сек

Кроме этого метода используют окраску по Селлерсу, по Манну.

Метод риноцитоскопии по Павловскому

На грипп.

При гриппе происходит сильное слущивание эпителия со слизистой оболочки носа. В эпителиальных клетках обнаруживаются тельца-включения. Для выявления этих телец готовят мазки-отпечатки из носовой слизи.

На мазок из носовой слизи (не фиксируя) наносят краску Павловского, состоящую из 100 кубиков дистиллированной воды, в которую добавляют 20-40 капель насыщенного спиртового раствора фуксина основного и 40-60 капель метиленовой синьки. Её наносят на препарат и выдерживают не менее 5 минут. Промывают, высушивают, микроскопируют. Обнаруживают эпителиальные клетки. Ядро окрашивают в синий цвет. Цитоплазма – в розовый, тельца-включения ярко розовые.

При некоторых вирусных заболеваниях, таких как бешенство, оспа, обнаружение телец-включений имеет важное диагностическое значение. При других вирусных заболеваниях это имеет второстепенное значение (как дополнительный метод исследования)