Горизонтально расположенные пластины
Преимущество такого расположения — не только в компакт- ности прибора, но и в отсутствии проблемы уплотнения. Оба электродных буфера находятся в резервуарах, расположенных ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель. Естественно, что этот столик используется и для отвода тепла от пластинки геля — в его каналах циркулирует охлаждающая вода.
Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке, помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку препарат вносят не с торца геля, а в ряд специальных «колод- цев», расположенных на некотором расстоянии от его края. Электрическая цепь замыкается через 8 — 10-слойные фитили из фильтровальной бумаги, одним концом погруженные в элект- родные резервуары, а другим — прижатые к гелю с перекрытием в 10 — 12 мм (рис. 10, 11). При наложении фитилей на гель сле- дует внимательно следить за отсутствием воздушных пузырей между ними.
Показанные на рис. 10 перегородки в электродных камерах препятствуют конвекционному переносу продуктов электролиза от электродов к концам фитилей. В ходе электрофореза на ано- де образуется свободная кислота, а на катоде — щелочь, кото- рые по плотности отличаются от электродных буферов, а это может вызвать конвекцию. Если электрофорез идет более 24 ч, электродные буферы следует заменять. Если же они одинаковы и между электродными резервуарами обеспечена циркуляция жидкости, то кислота и щелочь взаимно нейтрализуются — и бу- фер можно не заменять. В изображенном на схеме приборе
32
«Мультифор» (LKB, Швеция) циркуляция буфера не преду- смотрена, но объем каждой камеры составляет 1,2 л.
Во избежание подсыхания фитилей и геля прибор во время работы закрывают прозрачной крышкой (рис. 12), которую ино- гда называют антиконденсационной. Она предохраняет гель в случае существенного охлаждения от конденсации на его поверх- ности влаги из окружающего воздуха. Впрочем, сама крышка изнутри может запотевать за счет влаги, испаряющейся с фити- лей, особенно в случае их перегрева. Это ухудшает условия на- блюдения за ходом электрофореза, поэтому в аналогичном по конструкции приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) по пери- метру крышки у ее краев с внутренней стороны проходит трубка с охлаждающей водой. Пары влаги конденсируются на трубке, оставляя крышку прозрачной. Электродные резервуары у этого прибора съемные, что облегчает их промывку. В качестве фити- лей используется специально обработанная целлюлоза с повы- шенной влагоемкостью.
1 — антиконденсационная крышка; 2 — электродный резервуар; 3 — ко- лодец для внесения препарата; 4 — гель; 5 — фитиль; 6 — охлаждающий столик
Рис. 11. Наложение фитилей на гель в приборе «Мульти- фор»
33
Рис. 12. Наложение антиконденсацион- Рис. 13. Внесение препарата в ко- ной крышки лодцы геля
Описанные приборы не предъявляют строгих требований к качеству полимеризации геля у его краев, поскольку края геля не участвуют в электрофорезе. Полимеризацию пластины ПААГ для прибора «Мультифор» ведут в форме, уплотненной по всем четырем краям сплошной резиновой прокладкой. У одного из своих углов она разрезана, и через этот разрез, слегка отогнув прокладку, заливают раствор мономеров в форму. Последняя образована двумя пластинами: стеклянной (толщиной 1 мм) и толстой плексигласовой. На стеклянной пластине гель остается во время электрофореза. Пластину из плексигласа после поли- меризации геля снимают; на ней имеется ряд прямоугольных выступов, которые при заливке формируют колодцы для внесе- ния препаратов. Колодцы имеют фиксированный объем (для «Мультифора» — 5 и 10 мкл). В таком же объеме надо вносить и препарат, чтобы он заполнял все сечения геля, но не разли- вался по его поверхности. Для этого препарат дозируют микро- шприцем (рис. 13).
При сборке формы на стеклянную пластину накладывают еще одну толстую пластину из плексигласа и все вместе зажи- мают пружинными зажимами. Здесь нет необходимости наслаи- вать воду, да и к материалу уплотнительной прокладки можно не предъявлять высоких требований, поскольку в контакте с ней гель может и не заполимеризоваться. После освобождения геля оставшийся раствор мономеров по его краям можно убрать филь- тровальной бумагой. Для облегчения разборки формы ее сле- дует охладить в холодильнике.
Перед использованием ПААГ желательно выдержать не ме- нее 12 ч обернутым в полиэтиленовую пленку во избежание под- сыхания. Гели, содержащие додецилсульфат натрия (ДДС-Na),
34
не следует хранить в холодильнике, так как ДДС-Na мо- жет выпасть в осадок. При установке пластины с гелем на ох- лаждающий столик следует налить на него несколько милли- литров раствора детергента, чтобы обеспечить хороший тепловой контакт между столиком и пластиной. До этого имеет смысл про- вести на столике водонесмываемым фломастером две линии на расстоянии примерно 15 — 20 мм от каждого из противополож- ных краев. Эти линии будут видны через гель и помогут ровно уложить края фитилей, что немаловажно для создания в геле однородного электрического поля.
Следует быстро вносить препараты в колодцы и сразу же начинать электрофорез, так как бромфеноловый краситель склонен диффундировать в геле. В процессе разделения нужно следить за тем, чтобы колодцы с оставшимся в них буфером пре- парата не обсыхали. Это нежелательно, так как искажает рас- пределение тока по сечению геля. В ходе электрофореза можно пополнять колодцы буфером или с самого начала добавить в препарат 10—20% глицерина.
После электрофореза можно хранить гель на том же стекле, обернув его целлофаном, или предварительно перенести на ме- таллическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно и высушить.
Пластины для горизонтального электрофореза в агарозе можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально ус- тановленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло опре- деленного размера и на него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB реко- мендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы че- рез прорези наложенного на пластину специального шаблона со щелями. Препарат объемом 2 — 4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравни- тельно простое приспособление, смонтированное на столике для заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при заливке агарозы образовать колодцы для препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфе- ре в течение суток.
При электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозе использу- ют относительно большие токи, которые могут нагревать фити- ли из фильтровальной бумаги. Было предложено фитили делать тоже из агарозы — заливкой ее 1 — 2%-ного раствора в специ- альные камеры; описаны конструкции соответствующих прибо- ров [Kaplan et al., 1977; McDonell et al., 1977; Herrick, 1980]. На рис. 14 показан разрез одного из таких простых приборов. В приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) фитилями из 0,5%-
35
Рис.
14. Прибор
для препа-
ративного
горизонтального
электрофореза ДНК
в ага-
розном геле с агарозными
фитилями
1
— электродные резервуары; 2
—
форма
для заливки агарозы;
3
— съемные
перегородки; 4
—
гребенка
ного геля агарозы толщиной 6 мм оснащены специальные мо- стики, на которых можно вести препаративный электрофорез ДНК в пластинах геля агарозы толщиной до 1 см.
Вместе с тем для работы с микроколичествами препарата описано приготовление гелей для горизонтального электрофоре- за толщиной 0,1 мм на предметных стеклах. После высушива- ния такой гель образует настолько тонкую, не заметную глазом пленку, что она позволяет вести авторадиографию даже мечен- ных 3H препаратов [Amaldi, 1972].
Высоковольтный горизонтальный электрофорез в пластинах ПААГ толщиной 0,5 мм был использован для секвенирования нуклеиновых кислот. Для улучшения теплоотвода гель разме- ром 30 50 см, подложив под него тонкую пленку, укладывали на металлический охлаждающий столик самодельного прибора, накрывали еще одной пленкой и плотно, по всей поверхности прижимали к столику давлением наполненной воздухом подуш- ки [Kutateladze et а1., 1979].
36