Фракционирование гистонов и других щелочных белков.

5%-ный (0,9 М) раствор уксусной кислоты с добавлением 4 — 8 М мочевины часто используют для электрофоретического фракционирования гистонов [Panyim, Chalkley, 1969]. Молеку- лярные массы гистонов лежат в диапазоне 11 — 22 тыс. дальтон, поэтому для их разделения используют мелкопористые гели (T = 15 — 20). Положительно заряженные в кислой среде гисто- ны мигрируют в направлении катода. Наибольшей подвижностью обладает гистон Н4, затем следуют Н2А, Н2В и НЗ, которые в этой простой системе разделяются довольно плохо. От них за- метно отстает относительно более крупный гистон H1. В каче- стве лидирующего красителя используют пиронин.

Недавно Спайкер описал систему фракционирования гисто- нов в двуступенчатом ПААГ с «кислой мочевиной». Основной рабочий гель — пластина (толщиной 0,5 мм) 15%-го ПААГ в 0,9 М СН₃СООН с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована полоска формирующего геля: 7,5% ПААГ в 0,375 М СН₃СООК, рН 4, с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напря- жении — за 1 — 2 ч. Качество полос и их разрешение в такой си- стеме сильно выигрывают [Spiker, 1980].

Электрофорез «в кислой мочевине» успешно используют и для фракционирования других щелочных белков: рибосомных, факторов инициации трансляции, субъединиц РНК-полимеразы и др. Впрочем, намного более совершенное разделение сложных смесей этих белков происходит при двумерном электрофорезе, когда фракционирование «в кислой мочевине» используют в од- ном из направлений. Ниже, при анализе метода двумерного электрофореза, будут даны соответствующие ссылки.

Если есть опасение, что воздействие уксусной кислоты на бе- лок может оказаться слишком жестким, то ее 50%-ный раствор титруют КОН до рН 4,3 — 4,5. При этом надо иметь в виду, что электропроводность такого буфера будет за счет ионов калия значительно выше, чем одной уксусной кислоты, что потребует соответствующего уменьшения напряжения, подаваемого на гель.

Описано электрофоретическое разделение гистонов и при рН 7,8 (0,18 М глицилглицин, титрованный NaOH), которое ис- пользуется для изучения гистон-гистонового взаимодействия и некоторых лабильных модификаций гистонов. Все гистоны, кро- ме H1, при этом почти одинаково и относительно слабо заряже- ны, поэтому фракционирование идет главным образом по моле- кулярной массе. Добавление мочевины предупреждает агрега- цию гистонов, однако несколько изменяет взаимное расположе- ние полос. Мочевина разворачивает гистоны Н2А, Н2В и Н3, но не влияет на конфигурацию H1 и Н4. По-видимому, эти по-

55

следние развернуты и в отсутствие мочевины [Hoffman, Chalk- ley, 1976].

Щелочные белки рибосом удается разделять не только в кис- лых, но и в слегка щелочных условиях, например в Трис-борат- ном буфере, рН 8,7. Электрофорез проводят в 4%-ном ПААГ [Howard, Traut, 1973]. Исходный белковый препарат полимери- зуют в геле с мочевиной на середине высоты трубки. Вблизи изо- электрической точки часть рибосомальных белков оказывается заряженной отрицательно, а другая — положительно. Миграция в электрическом поле идет в обе стороны, к катоду и аноду. Ще- лочные белки рибосом при рН 8,7 растворяются с трудом и толь- ко в присутствии 6 М мочевины, которую вводят также и в бу- фер геля.

Электрофорез хроматина. Электрофоретическое фракциони- рование хроматина после его обработки микрококковой нуклеа- зой ведут в буфере низкой ионной силы, например в 0,01 М три- этиламмоний-НСl (рН 7,6; 2 мМ ЭДТА), что обусловлено плохой растворимостью хроматина в более концентрированных буферах. Хроматин в целом (благодаря ДНК) заряжен отрицательно и мигрирует к аноду. Удается разделить субнуклеосомы, моно- нуклеосомы с различным содержанием ДНК и белков, лежащих вне их «ядра» («core»), а также ди- и тринуклеосомы. Ввиду малой электропроводности разбавленного буфера при напря- женности 15 В/см сила тока через трубку диаметром 6 мм со- ставляет всего лишь 3 мА. Электрофорез в трубках длиной 7 см занимает 1,5 ч.