Введение мочевины и -меркаптоэтанола. Некоторые артефакты

Высокая концентрация белков в зонах может привести к их осаждению или, по крайней мере, образованию агрегатов: ди- мерных, тримерных и более крупных белковых комплексов, ко- торые могут давать дополнительные полосы. Агрегация проис- ходит, в основном, за счет водородных связей. Для ее предотвра- щения в рабочий буфер нередко добавляют мочевину в концент- рации 4 — 8 М. Она должна быть хорошо очищена, в частности деионизована. Кроме того, следует всегда иметь в виду возмож- ность частичного разложения мочевины с образованием циано- вой кислоты и карбамоилирования белков. Это особенно отно- сится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять сухую мочевину в буфер непосредственно перед приготовлением геля. Если все же возникает подозрение, что некая полоса появи- лась за счет карбамоилирования, то следует добавить в исход- ный препарат цианат и посмотреть, не усилится ли подозритель- ная полоса. Для предварительной деионизации маточный рас- твор мочевины (10 М) суспендируют с бифункциональной ионо- обменной смолой (например, AG 501  8) в соотношении 5 г смолы на 100 мл раствора в течение часа при комнатной темпе- ратуре.

-Меркаптоэтанол в концентрации 1 — 5% нередко вносят в исходный белковый препарат для предохранения его от окисле- ния и образования лишних дисульфидных мостиков. Более энер- гичное воздействие с разрывом нативных дисульфидных связей и разделением белковых субъединиц производят путем нагрева- ния белкового раствора до 90 — 100° в присутствии не только - меркаптоэтанола или его аналогов, но н ДДС-Na.

В некоторых случаях при использовании боратного буфера или буферов, содержащих аминокислоты (глицин, аланин), воз- можно образование комплексов компонентов буфера с белками. Их электрофоретическая подвижность может оказаться несколь- ко иной, чем у чистых белков, и соответствующие белковые по- лосы раздвоятся. Проверить такого рода артефакт можно по- вторным электрофорезом. В силу равновесного характера про- цесса образования комплексов каждая из двух полос дублета при ее повторном электрофорезе в том же буфере даст снова две полосы.

В главе 1 уже упоминалось об опасности, которую представ- ляют для белков сохраняющиеся в геле после полимеризации долгоживущие свободные радикалы. Указывалось также на спо- соб их удаления — «преэлектрофорез», т. е. пропускание тока через гель без внесения препарата. Добавим, что в особых слу- чаях для полной очистки от радикалов во время преэлектрофо- реза через гель пропускают такие связывающие их соединения, как цистеин, меркаптоуксусная (тиогликолевая) кислота или гидрохинон.

46

При фракционировании очень малых количеств белка может оказаться заметной сорбция их на геле (белки «размазывают- ся» по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исход- ный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Про- ходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле.