Разделение белков по размеру с использованием ддс-Na Существо метода

Рассмотренный выше электрофорез белков в простой систе- ме удобно использовать для их разделения, но не для характери- стики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в про- стой системе зависит одновременно и от его суммарного заряда, и от молекулярной массы, и от конфигурации, и, наконец, от жесткости упаковки полипептидной цепи. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно изменяться в зави- симости от условий электрофореза. Для установления строгой количественной корреляции между каким-либо одним из пере- численных параметров и электрофоретической подвижностью белка надо исключить влияние всех остальных.

Электрофорез в ПААГ с использованием ДДС-Na позволяет фракционировать белки в зависимости от значений только од- ного параметра — их молекулярной массы. Для этого белки в исходном растворе препарата обрабатывают не менее чем трех- кратным избытком ДДС-Na. За счет гидрофобных взаимодей- ствий детергент примерно одинаково связывается с подавляю- щим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДДС-Na на

56

1 мг белка [Reynolds, Tanford, 1970]. Огромный избыток пол- ностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привноси- мых с детергентом, в большинстве случаев делает несуществен- ной роль собственного заряда белка. Постоянство соотношения детергент/белок делает практически одинаковым отношение от- рицательного заряда к массе для любого белка, даже для гисто- нов с их заметным собственным положительным зарядом. Бла-

годаря электрическому отталкиванию тесно расположенных по поверхности белка остатков серной кислоты поли- пептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жесткого эллипсои- да вращения. Его малая ось имеет дли- ну 1,6 нм, а размер большой линейно связан с числом аминокислотных остат- ков, а следовательно, с молекулярной массой белка. Это справедливо лишь для неразветвленных полипептидов, ли- шенных дисульфидных мостиков, поэ- тому одновременно с обработкой ДДС- Na необходимо обеспечить полную де- натурацию белка и разрыв всех S—S- связей. С этой целью белковый препа- рат обрабатывают высокой концентра- цией -меркаптоэтанола при повышен- ной температуре.

Рис. 18. Линейная зависи- мость логарифма молеку- лярной массы (IgM) от от- носительного расстояния миграции белков (R_f) при электрофорезе в ПААГ

Электрофоретическая подвижность (и') жесткого комплекса белок — ДДС-Na оказывается связан- ной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением: и'=А — В lg М, где А и В — коэффициенты, зависящие от порис- тости геля, температуры и других условий эксперимента. Вели- чину и' удобнее представлять в относительных единицах, выра- жающих отношение путей миграции белка и бромфенолового синего за время электрофореза, т. е. в значениях введенной ра- нее величины R_f. Такая замена отразится только на значениях коэффициентов А и В. Нет смысла определять эти коэффициенты в каждом опыте. Одновременно с фракционированием исследуе- мой смеси можно провести электрофорез набора белков-«марке- ров», молекулярные массы которых точно известны. Разумеется, вся предварительная обработка ДДС-Na и меркаптоэтанолом должна быть строго одинаковой для исследуемого препарата и маркеров. При электрофорезе в пластине для смеси маркеров можно отвести отдельный трек. При использовании трубок мар- керы лучше добавить прямо в препарат, так как нельзя гаран- тировать строгой идентичности условий электрофореза в двух разных трубках.

По окончании электрофореза, измерив пути миграции бром- фенолового синего и каждого из маркеров, можно рассчитать значения R_f и, зная молекулярные массы маркеров, построить

57

экспериментальную зависимость lg M от R_f для данного опыта. Если пористость геля выбрана удачно (см. ниже), такая зави- симость получается линейной (рис. 18). Определив теперь r_f для интересующего нас белка, из графика можно найти для него величину lg M и подсчитать M. Положение и наклон прямой на графике изменяются при вариации концентрации ПААГ и других условий эксперимента, поэтому нельзя пользоваться ка- кой-либо стандартной калибровкой. График зависимости Ig M от R_f надо строить для каждого опыта. Отметим также, что при определении R_f надо вводить поправки на набухание или съежи- вание геля при фиксации, окраске белков и удалении красителя, приводя все к исходному линейному размеру.

Метод определения молекулярной массы белков электрофоре- зом в ПААГ с ДДС-Na завоевал себе прочную репутацию и ис- пользуется очень широко. Тем не менее следует проявлять из- вестную осторожность. Исследуемый белок может оказаться принадлежащим к той, по-видимому, сравнительно немногочис- ленной, категории белков, для которой количественное соотно- шение в комплексе с ДДС-Na существенно отличается от 1 : 1,4.

Есть данные о том, что на полноту комплексообразования с ДДС-Na может влиять распределение зарядов по полипептид- ной цепочке. Показано, например, что обработка рибонуклеазы малеиновой кислотой снижает количество связывающегося с ней ДДС-Na с 1,9 до 0,3 г на 1 г белка. Такая обработка не изме- няет заметным образом молекулярной массы рибонуклеазы, но вносит отрицательный заряд карбоксила на место положитель- ного заряда аминогруппы. С другой стороны, на связывании ДДС-Na с лизоцимом обработка малеиновой кислотой никак не сказывается [Tung, Knight, 1972]. Ненормальное связывание ДДС-Na может быть также обусловлено необычной обогащен- ностью белка какой-либо гидрофильной аминокислотой. Глико- протеиды хуже связываются с ДДС-Na, чем чистые белки.

Разной степенью связывания ДДС-Na, по-видимому, следует объяснить и успешное разделение - и -цепей глобина кролика электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ с ДДС-Na. Различие моле- кулярных масс этих цепей (15 419 и 16 000) вряд ли само по себе могло бы обеспечить это разделение (Wood, Shaeffer, 1975]. Недавно было показано, что единственная мутационная замена аминокислоты (АргЦис) в белке с молекулярной массой 26 000 приводит к кажущемуся изменению этой величины на 1000. Су- щественно отметить, что такое изменение связано с заменой только одного из нескольких остатков аргинина, входящих в со- став белка. Следовательно, в этом случае играет роль еще и окружение аргинина [Noel et al., 1979].

Рассмотренные примеры не могут дискредитировать плодо- творный метод определения молекулярной массы белков элект- рофорезом с участием ДДС-Na. Они лишь указывают на необхо- димость некоторой осторожности и критичности в оценке ре- зультатов эксперимента, особенно с малоизученными белками.

58