Локализация ферментов после электрофореза

В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях (без ДДС-Na или мочевины) не сказывается на их активности. Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с помощью специфических реакций, дающих окрашенные продук- ты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофак- торов, необходимых для протекания определенной ферментатив- ной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует, его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продви- жением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией фермента. Разумеется, при этом необходимо ясно представлять, каково будет поведение субстрата в электрическом поле во вре- мя электрофореза.

101

Можно заполимеризовать субстрат и кофакторы в другом («индикаторном») геле на основе агарозы или импрегнировать ими фильтровальную бумагу. После окончания электрофореза белков в пластине рабочего ПААГ на его поверхность наклады- вают индикаторный гель или бумагу. Ферменты диффундируют в них из рабочего геля и обнаруживают себя соответствующей цветной реакцией. Габриель привел длинный список индикатор- ных цветных реакций для ферментов [Gabriel, 1971]. Во многих случаях в этих реакциях фигурирует восстановление НАД с дальнейшей передачей электрона на краситель. Удобно в каче- стве заключительного этапа реакции воспользоваться нефермен- тативным восстановлением тетразолиевой соли до ее формазана,. что дает сильно окрашенные и зачастую нерастворимые продук- ты (схема реакции приведена ниже),

В качестве примера можно назвать часто употребляющийся препарат «Methyl thiazolyl blue» (MTT) или еще более сложное соединение «Nitro blue tetrazolium» (NBT). В окисленном виде

обе эти соли бесцветны. При восстановлении первая дает сине- пурпурную, а вторая—иссиня-черную окраску. Реакция восста- новления красителей ускоряется в присутствии промежуточного переносчика электронов «Phenazine methosulfate» (PMS) или нового, более стойкого реагента, выпускаемого для этой цели фирмой «Boehringer» под названием «Meldolablue» [Turner, Hopkinson, 1979].

102

Для обнаружения в геле протеолитических ферментов пред- ложен ряд нетривиальных методов. Например, после электрофо- реза гель вымачивают в течение 2 ч при 37° в 8%-ном растворе цитохрома с в буфере с рН 8,5, содержащем 8 М мочевину и 1,7 мМ CaCl₂. Затем белок фиксируют в 12,5%-ной ТХУ. Диф- фундируя в гель, цитохром с окрашивает его в коричневый цвет по всему объему. Полосы протеаз, разрушающих цитохром с, остаются прозрачными и хорошо видны на коричневом фоне [Ward, 1976]. Суть другого подхода заключается в том, что на гель накладывают обработанную закрепителем в темноте (для удаления серебра) и вымоченную в буфере фотопленку. После трехчасовой выдержки при 35° во влажной камере на фотоплен- ке можно обнаружить следы диффузии в нее протеаз, разрушаю- щих слой желатины [Burger, Schroeder, 1976].

Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы для своего действия нуждаются в ионах Mg²⁺, Са²⁺ или Zn²⁺, то в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофоре- за. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеино- вых кислот—бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нук- леаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием ДДС-Na из геля вымывают.

Заполимеризовав в ПААГ денатурированную ДНК, можно выявить нуклеазы, специфичные для однонитевых ДНК. Мож- но также исследовать оптимизацию условий, необходимых для активности нуклеаз, варьируя состав буфера геля, или опробо- вать различные ингибиторы нуклеазной активности. С помощью кольцевых ДНК удается отличить эндонуклеазы от экзонуклеаз. Электрофорезу можно подвергнуть лизаты бактерий для выяс- нения содержания в них нуклеаз [Rosenthal, Lacks, 1977]. Окра- шивание бромистым этидием в описанных опытах можно заме- нить авторадиографией (см. ниже), если в гель заполимеризо- вать меченную ³²Р нуклеиновую кислоту или синтетический полинуклеотид [Iborra et al., 1979].

Выше указывалось, что для локализации ферментов по их активности электрофорез желательно проводить в условиях, исключающих возможность денатурации. Однако в недавней ра- боте [Lacks, Springhorn, 1980] было показано, что очистку цело- го ряда ферментов (ДНКазы I, некоторых протеаз, амилазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) можно производить электро- форезом в ПААГ с ДДС-Na после соответствующей обработки их детергентом при повышенной температуре. Денатурация ока- зывается обратимой. По окончании электрофореза ДДС-Na от- мывают и одновременно снимают с белка встряхиванием геля в течение 1—2 ч в 0,04 М Трис-буфере, рН 7,6. Ферментативная активность в ряде случаев восстанавливается.

103

По данным Хагера и Буржесс, при снятии ДДС-Na с фермен- та имеет смысл денатурировать его кратковременной обработ- кой 6 М гуанидинхлоридом с последующей ренатурацей при раз- бавлении. Возможно, что при этом восстанавливается нативная конфигурация белка, нарушенная при первоначальной обработке ДДС-Na [Hager, Burgess, 1980]. Для ферментов, содержащих несколько полипептидных цепей (химотрипсин), предваритель- ную обработку (-меркаптоэтанолом, разумеется, следует исклю- чить. Впрочем, то же самое относится и к одноцепочечному трип- сину. По-видимому, разрыв внутрицепочечных S—S-связей в нем приводит к необратимой денатурации. Ферменты, состоящие более чем из двух субъединиц, не ренатурируют.

В заключение отметим, что гликопротеиды после электрофо- реза в ПААГ можно локализовать, вымачивая гель в растворе конканавалина А, конъюгированного с флюоресцентной меткой, например с флюоресцеинизотиоцианатом [Furlan et al., 1979], или радиоактивно меченного введением ¹²⁵I [Horst et al., 1980].