Выбор пористости геля

При данной пористости (концентрации) геля описанная выше линейная зависимость имеет место только для белков, молеку- лярные массы которых лежат в определенном интервале. Слиш- ком крупные для данного геля белки, очевидно, вовсе не смогут мигрировать в нем. Подвижности слишком малых белков, для которых поры геля практически не создают препятствий, будут зависеть не от их молекулярной массы, а только от отношения заряда к массе. Как указывалось, в присутствии ДДС-Na это отношение одинаково для большинства белков. Для ориентиров- ки можно назвать некоторые цифры. Так, для одинаково сши- тых гелей (С = 3,3) были рекомендованы следующие значения Т в зависимости от молекулярной массы белков (M) [Dunker, Rueckert, 1969]:

Фирма BDH для своего стандартного набора белков-марке- ров в интервале М 56 — 280 тыс. дальтон предлагает использо- вать гели с T = 3,3, а в интервале 14 — 72 тыс. — с T = 10; в обоих случаях С = 2,6. Отметим попутно, что эффект торможения миг- рации биополимеров в слабосшитых гелях с С < 2,6 быстро ос- лабляется с уменьшением С при неизменном значении Т. По- видимому, в этом случае ярко проявляется способность жестко- го комплекса белок — ДДС-Na раздвигать гибкие, слабосшитые нити акриламида.

Для определения молекулярных масс пептидов та же фирма выпускает набор стандартных фрагментов миоглобина с диапа- зоном М 2,5 — 17 тыс. Для него и соответствующих пептидов ре- комендуется использовать сильно сшитый гель (Т = 12,5; С = = 9), содержащий 8 М мочевину, которая усиливает торможение малых пептидов в геле.

О важности правильного выбора пористости геля можно су- дить из сопоставления двух картин разделения набора из семи маркерных белков (рис. 19) [Fehrnström, Moberg, 1977]:

Разделение вели в приборе «Мультифор», использовав 5%- и 10%-ный ПААГ. Легко видеть, что в 5%-ном геле миоглобин движется почти с такой же скоростью, как и цитохром с. При перенесении результатов этих опытов на графики (рис. 20) по- лучается, как и следовало ожидать, что точка, отвечающая по-

59

ложению цитохрома с в 5%-ном геле, выпадает из прямой ли- нии, проходящей через все остальные точки, тогда как для 10%- ного геля она оказывается на такой прямой.

Присутствие мочевины и неионных детергентов

Хотя для коротких олигопептидов присутствие мочевины ока- зывается полезным, при электрофорезе белков ее не следует вводить в гель. Мочевина вносит конформационные изменения в структуру белка. Влияние этих изменений как на степень связы- вания ДДС-Na, так и на характер миграции комплекса белок — ДДС-Na в геле еще не изучено.

60

Из аналогичных соображений следует удалять из белкового препарата перед его обработкой ДДС-Na другие детергенты, в частности неионные. Иногда это удается добиться за счет вне- сения в препарат еще большего избытка ДДС-Na, с тем чтобы он вытеснял неионный детергент из связи с белком, образуя с ним свободно растворенные смешанные мицеллы. Такие мицел- лы могут «уходить» от комплекса белок — ДДС-Na, быстро миг- рируя в электрическом поле [Nielsen, Reynolds, 1978]. Широко используемый для растворения мембранных белков Тритон Х-100 сильно мешает проведению электрофореза в ПААГ с ДДС-Na. Его можно извлечь из белкового препарата экстрак- цией хлороформом. Чтобы предотвратить выпадение плохо рас- творимых белков в осадок, перед экстракцией к препарату сле- дует добавить ДДС-Na до 1%, который в хлороформ не перехо- дит [Horikawa, Ogawara, 1979].