Флюорография

Для регистрации положения в геле белков, меченных три- тием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он нахо- дился в непосредственном контакте с радиоактивными белками в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит

113

из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгенов- ской пленкой того же типа, который используют при непрямой авторадиографии. По существу говоря, такой подход уже был рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геомет- рических размеров целой пластины геля, чего трудно добиться при импрегнировании в гель жидкого сцинтиллятора.

Повсеместное распространение для флюорографии гелей по- лучила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки. Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО), вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель перено- сят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде не- растворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова за- мещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна, но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате до- статочно продолжительного экспонирования на пленке появляет- ся картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле [Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре резко снижается чувствительность метода.

Гели с низким содержанием акриламида, например смешан- ные гели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для более концентрированных гелей метанол непригоден — гели в нем сжимаются.

Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу. К противоположной стороне геля во время сушки плотно приле- гает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше («стек- ленеет»), а на противоположной его поверхности остается влага, которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во избежание этого дефекта было предложено между свободной по-

114

верхностью геля и пленкой или резиной прокладывать слой по- ристого полиэтилена, через который вакуум подается и к этой поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].

Недавно было указано на возможность замены ППО в каче- стве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979]. Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки. Главное же преимущество этого реагента — в его водораствори- мости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в 10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем сушить и флюоро- графировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания следует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1—2 не- дель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).

После флюорографии для количественных определений ра- диоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать, дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и да- лее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффек- гивности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться только методом внутренней стандартизации.

Для правильного совмещения изображения на рентгеновской пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперны- ми отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают ра- диоактивными чернилами. С этой целью можно использовать любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впро- чем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю авторадиографии влажных гелей, например при регистрации ра- диоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так суще- ственно.

Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно ре- гистрировать в геле двойную метку ³Н и ¹⁴С (например, сопо- ставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси вводят радиоактивную метку по ³Н, в белки второй — по ¹⁴С. Обе смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом. Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и регистрируют флюорографией на пленку «Kodak IR-5» сцинтил- ляцию от обеих белковых смесей (³H+¹⁴С). С негатива делают контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности ока- зываются белыми. Затем с того же геля на неэкранированную пленку «Kodak NS-5T» при комнатной температуре регистрируют авторадиографией только ¹⁴С. К свету сцинтилляций эта пленка нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местона- хождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух белковых смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].

115

Авторадиографией и флюорографией можно пользоваться не только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении выре- зать плоский слой толщиной 0,5—1,5 мм. Описано простое приспо- собление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].

Флюорографию нитроцеллюлозных фильтров с перенесенны- ми на их «репликами» белков из геля осуществляют очень про- сто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высу- шивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую плен- ку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография и авторадиография нитроцеллюлозных фильтров осуществляется лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на поверхности фильтров.