Выбор рабочего буфера геля

Из изложенного ясно, что рН буфера в этом варианте элект- рофореза не играет существенной роли, так как заряд белка оп- ределяется его комплексированием с ДДС-Na. Обычно работают с нейтральными буферами. По традиции, идущей еще от пионер- ской работы Вебера и Осборн [Weber, Osborn, 1969], часто ис- пользуют 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 7,1. Его концентрация обусловлена только желанием обеспечить 10-кратное различие в электропроводностях буферов геля и препарата. В качестве по- следнего берут 0,01 М Na-фосфат, рН. 7,1. Как уже указывалось, такое различие обеспечивает концентрирование исходной поло- сы при переходе белков из буфера препарата в гель. Однако ввиду большой электропроводности Na-фосфатного буфера на- пряженность поля приходится ограничивать значением 5 В/см, что замедляет процесс разделения, поэтому вместе Na-фосфат- ного имеет смысл использовать другой, менее проводящий бу- фер, например имидазолфосфатный, рН 7. Молярность рабочего буфера можно снизить до 0,05 М, сохранив для буфера препара- та концентрацию 0,01 М. Это позволит значительно увеличить напряженность поля и сократить продолжительность электрофо- реза.

В электродных резервуарах обычно используют тот же буфер, что и в геле. В буферы вносят и ДДС-Na до концентрации 0,1%. Необходимость присутствия ДДС-Na в рабочем буфере геля одно время оспаривалась [Stoklosa, Latz, 1974]. Авторы цити- руемой работы утверждали, что ДДС-Na образует с белком прочный комплекс, не разрушающийся в процессе электрофоре- за. В более поздней работе, напротив, подчеркивается необходи- мость введения ДДС-Na в буфер геля или хотя бы в катодный буфер, откуда он будет поступать в гель. Показано, что ДДС-Na может выходить из комплекса с белком. В тех случаях, когда скорость миграции детергента в геле намного больше, чем бел-

61

ка, последний будет терять ДДС-Na и изменять свою подвиж- ность в геле [Kubo et al., 1979]. Это обстоятельство было пред- ложено использовать в своеобразном процессе двухстадийного электрофореза [Sorimachi, Condliffe, 1977]. После обычной об- работки ДДС-Na и -меркаптоэтанолом авторы сначала вели электрофорез в течение 2 ч в 10%-ном ПААГ, полимеризован- ном, как обычно, в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7) с 0,1% ДДС-Na. Через некоторое время буфер в катодном резервуаре заменяли на такой же, но без ДДС-Na. Это приводило к быст- рой очистке геля от детергента, мигрирующего к аноду. Затем от ДДС-Na освобождались и белки. Дальнейшее разделение шло уже по заряду белков. При этом рН буфера можно с самого на- чала выбрать оптимальным именно для второго этапа разделе- ния, поскольку на первом этапе в присутствии ДДС-Na рН роли не играет.

Подготовка белкового препарата

На эту операцию следует обратить особое внимание. Сопо- ставлять молекулярные массы белков по скорости их миграции можно только в том случае, когда есть уверенность в полной де- натурации белка при обработке его ДДС-Na.

Вебер и сотрудники ввели широко употребимую до сих пор процедуру обработки. Белковый препарат диализуют против 0,01 М Na-фосфата, содержащего 0,1% ДДС-Na и 0,1% -мер- каптоэтанола, удаляя из него остатки соли. Затем концентрации ДДС-Na и -меркаптоэтанола увеличивают до 1% (каждого) и прогревают препарат при 100° в течение 2 мин. Концентрация белка при этом должна составлять около 1 мг/мл [Weber et al., 1972]. Если предполагается присутствие в препарате протеаз, прогрев можно продлить до 5 мин. Показано, например, что трипсин и химотрипсин сохраняют значительную каталитиче- скую активность в .присутствии 1% ДДС-Na, но прогрев при 100° в течение 5 мин эту активность полностью подавляет [Рог- tci, Preston, 1975]. Если же при высокой температуре наблюда- ется неферментативный гидролиз белка, то прогревание при 100° можно заменить инкубацией при 37° в течение 2 ч. Перед нане- сением препарата на гель в него дополнительно добавляют - меркаптоэтанол до концентрации 4 — 5%.

Несмотря на жесткость описанной обработки, авторы метода рекомендуют при определении молекулярной массы малоизу- ченного белка проверить полноту его денатурации. Для этой це- ли они предлагают обрабатывать контрольный препарат белка по более сложной прописи, гарантирующей его полную денату- рацию (7 М гуанидинхлорид и 1,5%-ный -меркаптоэтанол с по- следующим алкилированием йодацетамидом). После этого фор- мируют комплекс белка с ДДС-Na и сопоставляют картины электрофореза белка, обработанного обычным способом, и кон- трольного препарата.

62

С другой стороны, некоторые белки, в частности липопротеи- ды, при кипячении с 1 % ДДС-Na и 1 % -меркаптоэтанола мо- гут выпасть в осадок и не войти в гель. В этих случаях прихо- дится уменьшать концентрацию -меркаптоэтанола или не вво- дить его совсем.

При повышенной температуре иногда обнаруживается уси- ленный протеолиз исходных белков. Известно, что денатурация белка многократно увеличивает его доступность для атаки про- теолитическими ферментами. ДДС-Na не входит в число их эф- фективных ингибиторов. Если опасность протеолиза существу- ет, в исходный препарат до денатурации белков вводят мощные ингибиторы протеаз: фенилметилсульфонилфторид (300 мкг/мл) и 1,10-фенантролин (1 мг/мл).