Определение радиоактивности белков после электрофореза в пааг

Аппаратура, сцинтилляторы, различные методы счета радио- активности белков, а также способы оценки эффективности этих методов требуют отдельного подробного рассмотрения. Ниже в очень сжатом виде будут описаны только некоторые приемы оценки радиоактивности белков после их электрофореза в ПААГ.

Счет радиоактивности в элюатах белка

Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с по- мощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной, поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля при таком подходе носит более или менее приближенный харак- тер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением белкового раствора.

Один из специфических вариантов счета радиоактивности элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового препарата. В нем используется способность комплекса белок— ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным рас- твором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на нитроцеллюлозных фильтрах типа «Millipore НА». К элюату бел- ка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6 М мочевиной добавляют в качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентра- ции 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ. Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. Пос- ле этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Ис- пользование фильтра типа «Millipore» здесь обязательно, так как в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комп- лексов белок—ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].

Для качественного определения радиоактивности ¹⁴С и ¹²⁵I белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм) можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из стекловолокнистых фильтров типа «Whatman GF» или даже на бумажном фильтре «Whatman N 1». Сушить достаточно 30 мин при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивно- сти ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].

109

Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C вклю- чает диффузию нефиксированных комплексов белок—ДДС-Na из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные 10%-ным раствором NH₄OH. Диффузия идет в течение суток при комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры .сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всег- да при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молеку- лярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].

Растворение пааг

Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при по- вышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода. Если белки мечены ¹⁴С, то к раствору Н₂О₂ следует добавить NH40H ,до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный ¹⁴СО₂. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в такой смеси при 65° в течение 4—6 ч и далее просчитывать ра- диоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а воз- можность артефактов — тушения и хемолюминесценции — вы- ше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного растворения геля в Н₂О₂ с NH₄OH иногда предпочитают исполь- зовать один из фирменных «солюбилизаторов» и считать радио- активность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Mat- zura, 1971 ]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в 30%-ной Н₂О₂ с 5% NH40H (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтил- лятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под наз- ванием «Aquasol». Для подавления хемолюминесценции щелоч- ного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ле- дяной уксусной кислоты.

Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солю- билизаторов. Так, «Soluene» фирмы «Packard» растворяет ПААГ в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60— 65°. В солюбилизаторе NCS фирмы «Nuclear Chicago» при ана- логичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN («New Eng- land Nuclear») рекомендует для обработки ПААГ использовать 3%-ный раствор солюбилизатора «Protosol» в сцинтилляцион- ной смеси под названием «Econofluor». За ночь при 37° гель на- бухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец, недавно был предложен специальный «коктейль», содержащий 6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл «Hyamine 10X hydroxide» в 1 л то- луола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной темпера- туре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка [Aloyo, 1979].

Тщательное сопоставление всех перечисленных выше мето- дов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилуч-

110

шие результаты, по данным автора, дает обработка' предвари- тельно растертого геля в течение ночи при комнатной темпе- ратуре 1%-ным раствором солюбилизатора «Soluene 350» в то- луоле, содержащим 0,5% ППО и 0,05% вторичного сцинтиллято- ра MSB фирмы «Packard». Для ускорения процесса можно предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл «Solue- ne 350» при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития состав- ляет около 60%, а выход достигает 90—95%.

Полное растворение геля легко осуществить в том случае, когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В гла- ве 1 уже был назван в этом качестве NN^/-диaллилтapтapдиaмид (ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте растворимого геля используют NN^/-(l,2-диoкcиэтилeн)-биcaкpи- ламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ4 при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O'Connel, Brady, 1976] утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более вос- производимыми характеристиками, чем при использовании ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилил- цистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида [Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в -меркаптоэтаноле за 2—3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тон- костей, которые необходимо учитывать во избежание образова- ния дополнительных, устойчивых к воздействию (3-меркаптоэта- нола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN^/-Бисакрилилцистамин в настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и ДОЭБА.

Несмотря на свою кажущуюся привлекательность раствори- мые ПААГ не получили широкого распространения — скорее всего; ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень легко — простым нагреванием — расплавляются гели агарозы, но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отло- жить до следующей главы.