Оглавление

Часть первая ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Введение .................. 3

Глава 1

Гели для электрофореза .................. 7

Полиакриламидный гель (ПААГ) ................ 7

Исходные материалы ................... 7

Процесс полимеризации ПААГ ............... 10

Выбор концентраций мономеров .............. 13

Агароза ......................... 16

Смешанный гель (агароза+ПААГ) .............. 20

Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная ПААГ ....... 21

Глава 2

Техника приготовления гелей и аппаратура ........... 21

Вертикально расположенные трубки ....-..........: 21

Вертикально расположенные пластины .............. 26

Горизонтально расположенные пластины ............ 32

Глава 3

Электрофорез белков .................... 37

Замечания общего характера .................. 37

Миграция белков в геле ................. 37

Напряженность электрического поля (H) ......... 38

Выбор буфера рабочего геля ............... 40

Выделение тепла при электрофорезе ............ 42

Загрузка геля. Ширина белковых зон ............ 44

Введение мочевины и (З-меркаптоэтанола. Некоторые артефакты . 46

Лидирующие красители ................. 47

Разделение белков по размерам и заряду ............ 48

Выбор рабочего буфера ................. 48

Использование мочевины ................. 50

Загрузка геля и подготовка препарата ..;......... 52

Некоторые примеры ................... 53

Разделение белков по размеру с использованием ДДС-Na ..... 56

Существо метода ..................... 56

Выбор пористости геля .................. 59

283

Присутствие мочевины и нейояных детергентов ........ 60

Выбор рабочего буфера геля ............... 61

Подготовка белкового препарата .............. 6в

Проведение электрофореза .........;...... 63

Окрашивание и элюция белков .............. 64

Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis) ......... 66

Градиент пористости ПААГ .................. 73

Двумерный электрофорез в ПААГ ................ 76

Электрофорез с использованием Тритона Х-100 в цетавлона .... 83

Тритон Х-100 ..................... S3

Цетавлон ................. 85

Окрашивание белков в ПААГ ................ 88

Кислые красители ................... 90

Другие красители и методы окрашивания .......... 94

Флюоресцентные красители ................ 97

Локализация ферментов после электрофореза ......... 101

Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na . .... . . 104

Элюция белков из геля ............. 105

Определение радиоактивности белков после электрофореза в ПААГ . 109

Счет радиоактивности в элюатах белка ........... 109

Растворение ПААГ .................... 110

Импрегнирование сцинтиллятора в гель ........... 111

Авторадиография .................... 112

Флюорография ..................... 113

Препаративный электрофорез белков .............. 116

Глава 4

Электрофорез нуклеиновых кислот………………………………………………………... 120

Замечания общего характера………………………………………………………………….. 120

Выбор буфера геля и напряженности электрического поля……………………………..120

Выбор характера геля и его пористости…………………………………………………. 121

Влияние вторичной структуры…………………………………………………………… 123

Маркерные молекулы……………………………………………………………………... 125

Лидирующие красители…………………………………………………………………… 126

Электрофорез в мягких условиях……………………………………………………………... 126

Фракционирование плазмид и фрагментов ДНК…………………………………………126

Фракционирование РНК…………………………………………………………………... 128

Электрофорез в денатурирующих гелях……………………………………………………… 128

Щелочные гели…………………………………………………………………………….. 129

Гели, содержащие мочевину. Секвенирование ДНК и РНК……………………………..131

Денатурирующие гели с формамидом…………………………………………………… 135

Денатурирующие гели с формальдегидом………………………………………………. 138

Гели, содержащие гидроокись метилртути……………………………………………… 140

Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем………………………………………….. 142

Использование градиентов пористости ПААГ………………………………………………. 142

Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов………………………….. 144

Некоторые особые случаи электрофореза нуклеиновых кислот……………………………. 147

Электрофорез в геле агарозы тройного комплекса ДНК—РНК-поли-

мераза—РНК………………………………………………………………………………... 147

284

Выявление мРНК при электрофорезе суммарной РНК в геле агарозы 148 Использование жидкого (не сшитого) ПААГ……………………………………………….149

Окрашивание нуклеиновых кислот после электрофореза ...... 150

Элюция нуклеиновых кислот из гелей ............. 153

Элюция из ПААГ за счет диффузии ............ 153

Элюция из гелей агарозы ................ 154

Электрофоретическая элюция ............... 158

Перенос нуклеиновых кислот из геля на нитроцеллюлозные фильтры

и диазобумагу ..................... 162

Определение радиоактивности ................ 165

Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот ........ 166

Литература ....................... 168

Часть вторая УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

Введение ......................... 174