Импрегнирование сцинтиллятора в гель

Возможен и обратный подход к решению проблемы счета ра- диоактивности белка после электрофореза — вместо элюции бел- ка можно попытаться импрегнировать сцинтиллятор в кусочек геля, заменив им водное окружение радиоактивного белка и со- хранив при этом прозрачность геля. Такая попытка реальна. В одном из описанных вариантов ПААГ дегидратируют в абсо- лютном этаноле, потом этанол заменяют на толуол, а его—на толуол-тритоновый сцинтиллятор [Gezelins, 1977]. По-видимому, лучше начинать с замены воды в геле на диметилсульфоксид.

111

При этом гель не будет съеживаться и терять прозрачности как это происходит при вымачивании его в этаноле.

Во всех случаях, когда обработке геля предшествует его раз- резание, следует стремиться к тому, чтобы в одном кусочке геля была вырезана целая полоса или все белковое пятно. Широко распространенная практика разрезания цилиндрика геля на оди- наковые диски толщиной 1—1,5 мм неудачна, так как разрез «вслепую» может попасть на середину полосы. В результате это- го радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в двойном объеме геля, что даст ложную картину вдвое более ши- рокого и низкого пика радиоактивности на электрофореграмме.

Разумеется, для того чтобы правильно вырезать белковую полосу, ее надо окрасить, а это трудно сделать при малой кон- центрации белка в полосе, что нередко имеет место при фрак- ционировании радиоактивно меченных белков. Однако разработ- ка новых высокочувствительных методов окрашивания белков, например серебром, поможет решить эту проблему.

Авторадиография

Регистрацию полос радиоактивных белков в пластине геля можно осуществить методом авторадиографии. На гель наклады- вают рентгеновскую пленку и экспонируют ее в течение длитель- ного времени в темноте, обычно при комнатной температуре. Экспозицию ведут в кассете, где пленка прижимается к гелю пружинами через резиновую прокладку. В зависимости от уров- ня радиоактивности белков экспозиция может длиться от не- скольких часов до многих дней. Затем пленку проявляют обыч- ными проявителями, предназначенными для получения макси- мально контрастного изображения. Под действием -излучения участки пленки, лежавшие над белковыми полосами и пятнами, чернеют. Авторадиографию имеет смысл проводить только в тех случаях, когда белки мечены радиоактивным углеродом или йодом. Энергия излучения трития слишком мала, чтобы испус- каемые им -частицы смогли преодолеть воздушный промежуток между гелем и пленкой, да и просто вылететь из пластины, ввиду их сильного поглощения в геле.

Потеря энергии -частиц в геле достаточно велика и в слу- чае использования радиоактивного углерода, поэтому перед авторадиографией гель высушивают. Кстати, толщина высушен- ного геля будет тем меньше, чем меньше содержание в нем ме- тиленбисакриламида. Для высушивания гель переносят на фильтровальную бумагу («Whatman 3MM»), под нее подклады- вают пористую прокладку и перфорированную металлическую пластинку. Все это помещают в полиэтиленовый мешок и при- соединяют к вакуумному насосу. При подогревании в горячей воде или под лампой гель высыхает за 1—2 ч, образуя тонкую прочную пленку на поверхности фильтровальной бумаги. Есть множество фирменных устройств для сушки гелей. В них пласти-

112

ну геля обычно кладут на подключенную к вакуум-насосу по- ристую основу и накрывают листом тонкой резины, которую при- сасывает вакуумом. Во избежание прилипания резины к гелю под нее можно положить тонкую пленку. Несмотря на высуши- вание, регистрация р-частиц углерода из глубинных слоев не- возможна для гелей с исходной толщиной более 0,4 мм.

Для авторадиографии следует использовать неэкранирован- ную рентгеновскую пленку типа «Kodak No Screen X-Ray Film», например: NS-5T (США) или РТ-1 и РТ-2 (СССР). Фирма LKB (Швеция) рекламирует пленку, пригодную для авторадио- графии препаратов, меченных тритием, под названием «LKB- Ultrafilm». Суть дела здесь не в повышении чувствительности, а в отсутствии защитного слоя над фотографической эмульсией. Это облегчает проникновение в нее «слабых» -электронов три- тия, но затрудняет последующую обработку пленки. Чувстви- тельность метода авторадиографии для регистрации ¹⁴С можно оценить из следующих ориентировочных данных. Радиоактив- ность порядка 25000 распадов в минуту, равномерно распреде- ленная по площади 1 см², надежно регистрируется за 24 ч экспо- зиции.

Для регистрации -излучения ¹²⁵I удобно применять способ «непрямой» авторадиографии. -Излучение регистрируется рент- геновской пленкой, но большая его часть пронизывает ее и те- ряется, поэтому позади пленки устанавливают так называемый «интенсифицирующий экран», покрытый твердым сцинтиллято- ром (CaVO₄). Под действием -излучения экран флюоресцирует, а свет этой флюоресценции регистрируется пленкой. Разрешение и резкость полос при этом несколько ухудшаются, поскольку экран удален от геля на толщину пленки, а не все -частицы вы- летают из геля перпендикулярно его поверхности, зато выигрыш в чувствительности получается значительный.

Для непрямой авторадиографии следует использовать экра- нированные рентгеновские пленки, например: «Kodak X-Omat R» и «Kodak RP-50» (США) или РМ-1 (СССР). Интенсифицирую- щие экраны выпускают, в частности, фирма «Du Font» (США) под названием «Lightning Plus Intensifying Screen» и химфарм- завод им. Семашко под маркой ЭУ-ВЗ.

Для повышения чувствительности пленки ее иногда предва- рительно засвечивают до плотности потемнения (после проявле- ния), соответствующей A₅₄₀=0,2—0,3. Объяснение этого стран- ного на первый взгляд феномена можно найти в работе [Laskey, Mills, 1975].