Электрофорез с использованием тритона х-100 и цетавлона Тритон х-100

Многие белки, например: рибосомальные и мембранные, пло- хо растворимы в водных буферах. Добавление Тритона Х-100 за- частую улучшает их растворимость и, .к тому же, в отличие от мочевины, не влечет за собой их денатурации. Сохраняются вторичная и третичная структура белков, а в ряде случаев и их биологическая активность.

Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли бел- ки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в 1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с бел- ком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость белка, однако разделение полос оказывается более надежным, если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксиро- вании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, ко- торый приходится дольше отмывать.

Образование комплексов с Тритоном Х-100 можно использо- вать не только для растворения, но и для фракционирования белков. Характер комплекса и количество связавшегося с бел- ком детергента зависят от протяженности гидрофобного участ- ка на поверхности белковой глобулы. Некоторые белки могут связывать по нескольку десятков молекул Тритона Х-100 на мо- лекулу (родопсин—до 70). Это дает прирост эффективной мо- лекулярной массы в тысячи, а иногда и в десятки тысяч дальтон (молекулярная масса Тритона Х-100 равна 632). Такой прирост легко обнаружить электрофорезом в мелкопористом геле.

В работе Фернандеса и соавторов [Fernandes et al., 1978] бел- ки из бактериальной мембраны экстрагировали до концентра- ции 4 мг/мл 5%-ной уксусной кислотой с 4 М мочевиной и 5% (-мсркаптоэтанолом. Иногда уже при экстракции добавляли Тритон Х-100 до концентрации 2%, что улучшало выход белков из мембраны, но приводило к появлению дополнительных полос в верхней части геля при электрофорезе. Весьма существенно вносить Тритон Х-100 и мочевину в сам гель, причем в опреде- ленной пропорции. Мочевина препятствует связыванию Тритона Х-100 с белком, тем самым повышая избирательность этого про- цесса. Оптимальное соотношение концентраций детергента и мочевины для данного типа белков подбирают эксперименталь- но. В цитируемой работе использовали пластину 12%-ного ПААГ (С = 0,8), полимеризованного в 5%-ном растворе уксус- ной кислоты с 8 М мочевиной и 12 мМ (0,75%) Тритоном Х-100. Следует иметь в виду, что детергент ухудшает сцепление ПААГ со стеклом. Этим, по-видимому, и было обусловлено понижен-

83

ное против обычного содержание метиленбисакриламида. Иног- да, во избежание выскальзывания мелкопористого геля, содер- жащего Тритон Х-100, из трубки или пластины под ним прихо- дится предварительно заполимеризовать «пробку» обычного ПААГ. Тритон Х-100 усиливает опасность окисления белков за счет остаточных свободных радикалов, поэтому особое внима- ние следует уделить преэлектрофорезу. Авторы работы вели его сначала в течение 3—4 ч при напряжении 240 В до постоянства силы тока, подключив анод к нижнему электроду. Затем в элек- тродные резервуары заливали свежую 5%-ную уксусную кисло- ту, а в карманы пластины вносили 0,2 М цистамина и до 2 мг/мл протамина, растворенных в 5%-ной уксусной кислоте с 8 М мо- чевиной. Возобновляли преэлектрофорез еще на 45 мин, поме- няв полярность напряжения, подаваемого на гель. Только после этого вносили белковые препараты и вели электрофорез при по- стоянном напряжении 100 В в течение суток при той же поляр- ности напряжения (белки мигрируют к катоду).

В рассматриваемой работе удалось наблюдать значитель- ные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. со- li и даже мутантов одного штамма. Было использовано и дву- мерное разделение. Полоски геля после электрофореза в при- сутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сна- чала в 1,5 М Трис-НСl (рН 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М Трис-НСl (рН 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После это- го их переносили на вторую пластину для ступенчатого электро- фореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочеви- ны или ступенчатым электрофорезом по Лэммли.

Электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ, полимеризованном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,5% Тритона Х-100 и 6 М мочеви- ной, удается также хорошо разделять разные формы а- и {-це- пей глобина [Rovera et al., 1978]. Предварительную денатура- цию белков в этом случае проводили в присутствии 5% (-мер- каптоэтанола, так как окисление может существенно изменять гидрофобные свойства белка.

Аналогичное фракционирование гистонов проводили в геле, полимеризованном в 0,9 М уксусной кислоте с 0,38% Тритона Х-100 и 8 М мочевиной [Newrock et al., 1978]. Здесь также пре- электрофорез вели сначала с цистамином, затем с протамином. В более поздней работе [Levy et al., 1979] для разделения гисто- нов использовали другую пропорцию тех же компонентов буфе- ра геля: 7%-ная уксусная кислота+0,22% Тритона Х-100 + 4 М мочевины.

Электрофорез в кислой мочевине с добавкой Тритона Х-100 использовали и для очистки гистонов от примеси рибосомаль- ных белков. Тритон Х-100 плохо связывается с последними, по- этому при электрофорезе в первом направлении благодаря ком- плексу с Тритоном Х-100 гистоны удается отделить от рибосо-

84

мальных белков с близкими молекулярными массами. Гистоны мигрируют вместе с относительно более крупными белками ри- босом. Во втором направлении электрофорез в пластине 1'5%- ного ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na позволяет выявить раз- личие истинных молекулярных масс этих двух типов белков. ДДС-Na вытесняет Тритон Х-100 из комплекса с белком, и от- носительно более низкомолекулярные гистоны уходят вперед,. отделяясь от рибосомальных белков [Savic, Poccia, 1978].

Вообще, двумерный электрофорез гистонов, включающий комплексообразование с Тритоном Х-100 в одном из направле- ний, использовался довольно -часто [Hamana, Iwai, 1976; Gar- nird, 1976; Franklin, Zweidler, 1977; Blankstein et al., 1977]. В последние годы описано применение в тех же целях других, сходных с Тритоном Х-100 неионных детергентов. Так, после обычного электрофореза в кислой мочевине для второго направ- ления был использован 15%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,8 М уксусной кислоте, содержащей 0,4% Lubrol WX (фирмы «Sigma») и 6 М мочевину [Bhatnagar, Bellve, 1978]. Гистон Н2А печени и других органов мыши при этом удалось разделить на два компонента, гистон НЗ—на три или четыре; в ряде случа- ев расщеплялся и гистон HI. В другой работе [Allis et al., 1979] был использован Тритон DF-16. В 12%-ном ПААГ, полимеризо- ванном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,4% Тритона DF-16 и 6 М мочевиной, гистоны мигрируют в следующем порядке: Н4, Н1+ +Н2В, НЗ и Н2А. Электрофорез по размерам во втором направ- лении (система Лэммли) разделяет их очень хорошо.