Проведение электрофореза

Что касается режима электрофореза, т. е. выбора рабочего напряжения, силы тока и продолжительности разделения, то здесь остаются в силе все те соображения, которые были приве- дены в предыдущем разделе. Вкладом ДДС-Na в электропро- водность рабочего буфера можно при этом пренебречь. Электро- форез не следует вести на холоду, так как это может повлечь за собой выпадение ДДС-Na в осадок (его растворимость очень сильно зависит от температуры). При длительном электрофоре- зе электродные буферы следует обновлять.

Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na становится ненадежным даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимо- действие с ДДС-Na, уже не усредняются. Степень надежности определения молекулярной массы малых белков и олигопепти- дов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8 М мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля. В 12,5%-ном ПААГ с 0,1% ДДС-Na в присутствии 8 М мочеви- ны при электрофорезе малых (данзилированных) олигопептидов с диапазоном М от 1 до 12 тыс. дальтон наблюдалась хорошая линейная зависимость lg M от R_f [Kato et al., 1975], однако точки для инсулина (М=5782) и глюкагона (M = 3483) из графика этой зависимости выпадали.

Разделение улучшается в случае малых исходных количеств белка (1 — 5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции око- ло 15 см. При определении молекулярной массы неизвестного белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соот- ветствующего набора стандартных маркеров. Затем следует поварьировать условия — и, в частности, сопоставить значения молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в ге- лях с различным содержанием акриламида.

В цитированной выше работе Вебера и др. приведен список около 40 стабильных белков, которые можно использовать в ка-

63

честве стандартных маркеров в интервале М 12 — 200 тыс. даль- тон. Однако молекулярные массы продажных белков, особенно при М > 70 тыс., далеко не всегда надежно известны, поэтому фирма BDH при разработке своих стандартных наборов марке- ров пошла по другому пути. Она готовит каждый из наборов на основе только одного белка с хорошо известным значением М, сшивая его в димеры, тримеры и далее вплоть до гексамеров обработкой глутаровым альдегидом. Аналогичный подход в свое время был описан и в лабораторной практике [Inouye, 1971]. Кстати, автор цитируемой работы проводил одновременно и дан- зилирование своих маркерных белков, что позволяло ему фик- сировать их положение при УФ-освещении без окраски геля.

При определении молекулярной массы коллагена использо- вание глобулярных белков в качестве маркеров возможно в том случае, если строить график зависимости от расстояния мигра- ции. не самой молекулярной массы белка, а длины его полипеп- тидной цепи (логарифма числа аминокислотных остатков). Ско- рость миграции зависит именно от размера молекулы белка — переход к молекулярной массе предполагает некое среднее ее значение, приходящееся на один остаток. Между тем, в состав коллагенов входит необычно много легких аминокислот: глици- на, аланина, пролина [Noelken et al., 1981].