Навч.посібник Акушерство, гінекологія та штучне осіменіння с.г. тварин, Харута, 2013

для сперми бугая, кнура і жеребця та – 25–30 °С для сперми барана.

Сучасні синтетичні середовища розріджують у дистильо ваній або бідистильованій воді. Готують середовище у день отримання сперми (за 25–30 хв до отримання) і використовують для розрідження сперми не пізніше 3 годин після приготування. У мірний циліндр наливають необхідний об’єм дистильованої або бідистильованої води та підігрівають на водяній бані до температури +30–35 °С впродовж 10–15 хв. Розгерметизовують пакет з середовищем і висипають його у колбу з дистильованою або бідистильованою водою обережно помішуючи круговими рухами або стерильною скляною паличкою. Залишають до повного розчинення середовища так щоб розчин був прозорим.

Після отримання сперми у плідників проводять її візуальну та лабораторну оцінку, вимірюють температуру, після чого розріджують у відповідному співвідношенні. Температура розріджувача і сперми у момент розрідження повинна бути однаковою (допускається відхилення в ± 1 °С). Середовище обережно доливають до сперми невеликими порціями постійно помішуючи її скляною паличкою. Після розрідження обов’яз ково перевіряють сперму на рухливість.

До розрідження допускається сперма бугая з рухливістю не менше 8 балів і концентрацією не менше 800 млн сперміїв в 1 мл еякуляту. Таку сперму можна розбавляти в 10–20–50 разів. Спочатку її розбавляють безпосередньо в спермозбирачі в пропорції 1:1 – 1:2 і після 5–10 хвилинної витримки розбавляють додатково до потрібного об’єму. При цьому синтетичне середовище підливають по стінці посудини невеликими порціями з наступним нахилом змішувача в горизонтальне положення і обертанням його навколо осі після додавання кожної порції. Після розрідження при використанні всіх способів зберігання в спермодозі бугая повинно бути не менше 15 млн сперміїв із прямолінійно поступальним рухом, а рухливість повинна становити 4 і більше балів.

91

Сперму барана розріджують лише густу, з рухливістю не менше 9 балів. Розріджують її у 2–4 рази (1:1; 1:3) у спермоприймачі або стерильному флаконі. Після розрідження концентрація сперміїв з прямолінійно поступальним рухом у спермодозі повинна становити не менше 80 млн сперміїв в

1 мл.

Сперму жеребця допускають до розрідження з рухливістю не менше 6 балів і з концентрацією не менше 150 млн сперміїв в 1 мл сперми. Її можна розбавляти в 3–4 рази (1:2; 1:3), але так, щоб кількість сперміїв у дозі становила 3 млрд і більше.

Сперму кнура розріджують середовищем за рухливості не менше 8 балів і концентрації не менше 100 млн сперміїв у 1 см3. Розрідження еякуляту проводять у 1–5 разів у стерильній колбі

(табл. 8).

Таблиця 8

Ступені розрідження сперми кнурів плідників

Перед осіменінням свиноматок можна провести додаткове розрідження, але так, щоб в 1 мл сперми було не менше 40–50 млн сперміїв, а в дозі – не менше 3 млрд статевих клітин. Допускається до використання сперма з рухливістю 6 та більше балів.

92

2.16. СПОСОБИ ЗБЕРІГАННЯ СПЕРМИ

Короткочасне зберігання сперми при температурі льоду,

який розстає (+2 +4 °С). Свіжоотриману сперму бугая або барана розріджують глюкозо цитратно жовтковим або молочно жовтковим (молоко – 100 мл, жовток курячих яєць – 20 мл) середовищем, перевіряють на рухливість і фасують в одноразові стерильні поліетиленові ампули, поліетиленові пробірки об’ємом 1 мл або у флакони з під антибіотиків. Флакони заповнюють повністю для попередження збовтування сперми під час транспортування. Поліетиленові ампули запаюють, а пробірки і флакони закривають стерильними нетоксичними пробками і закріплюють їх гумовими кільцями. На кожній ампулі попередньо пишуть номер плідника і дату одержання сперми. Для попередження температурного шоку та загибелі сперміїв охолодження сперми проводять поступово. Для цього заповнені флакони та ампули залишають при кімнатній температурі (18–20 °С) на 20–30 хв, після чого їх обгортають шаром вати товщиною 1–2 см і вкладають у поліетиленові мішечки, які поміщають у термос із льодом, який розстає, або в холодильник для поступового охолодження до температури

+2 +4°С.

Зберігання сперми при температурі +5 +20 °С. Для зберігання сперми при такій температурі в синтетичне середовище, з метою гальмування обмінних процесів у статевих клітинах, додають компоненти, які зумовлюють їх анабіоз. Найефективнішим для зберігання сперми бугая є використання двоокису вуглецю (СО2). При цьому використовують спеціальний розріджувач: води дистильованої – 1000 мл; натрію двовуглекислого – 21 г; натрію цитрату – 23,6 г; калію хлористо го – 0,4 г; глюкози – 3,0 г; стрептоциду білого – 3,0 г.

93

Посудину із вказаним середовищем підігрівають до 96 °С в гарячій воді до розчинення стрептоциду, потім охолоджують до 20–22 °С і насичують двооксидом вуглецю доти, поки рН розріджувача досягне рівня 6,35. Для насичення використовують балонний СО2 або газ, який виділяється в результаті додавання до мармуру 20% ого розчину соляної кислоти. Для очищення вугільної кислоти від токсичних домішок її пропускають крізь 15% ий розчин двовуглекислої соди і 3% ий розчин перман ганату калію. Очищеним таким чином двоокисом вуглецю протягом 10 хвилин насичують середовище для розбавлення сперми. Після цього в розріджувач добавляють жовток курячого яйця – 11 мл, 1 млн од. пеніциліну і 1 млн од. стрептоміцину. Підігрівають розріджувач у теплій воді до температури 30–35°С і розріджують сперму бугая у співвідношенні 1:10–1:40, залежно від її концентрації.

Розріджену сперму зразу ж фасують у скляні ампули і запаюють їх, потім поміщають у термос і зберігають при температурі +18 +20 °С до 5 діб.

Для розрідження і зберігання сперми кнура при темпе ратурі 16–18°С застосовують сучасні синтетичні середовища

(табл. 9).

Розріджену сперму фасують у скляні колби або поліе тиленові флакони і зберігають у стерильному боксі термостаті або в спеціальних термосах для зберігання і транспортування. Колби закривають не герметично (пергаментним папером), без закріплення їх гумовими кільцями. Транспортують сперму в спеціальних термосах, побутових сумках холодильниках, термосах ящиках, у яких для теплоізоляції використовують паралон. Сперму можна транспортувати лише через 30 хвилин після розрідження. Допускається короткочасне (1–3 год) поступове зниження температури до 14–15 °С.

94

Таблиця 9

Термін зберігання сперми кнурів залежно від середовища

Для розрідження і короткочасного (протягом 48 год) зберігання сперми жеребця при температурі +2 +5 °С використовують середовище ЛХЦЖ, INRA 96. Сперму розбавляють у співвідношенні 1:3 при температурі 25–30 °С. Охолоджують розбавлений еякулят поступово.

Довготривале зберігання сперми в глибокозамороженому стані (кріоконсервація). Довготривале зберігання статевих клітин можливе лише за умови повного їх анабіозу.

Кріоконсервацію сперми бугаїв проводять у формі відкритих і облицьованих гранул та пайєт (соломинок).

95

Для розрідження і заморожування сперми бугая у формі відкритих гранул застосовують лактозо жовткове середовище з гліцерином. Розріджують сперму після її оцінки так, щоб в одній гранулі (0,2 мл) після розморожування містилось не менше 15 млн сперміїв з ППР. Розріджену сперму (температура +31±1 °С) охолоджують поступово (20–30 хв) до кімнатної температури (+18 +20), потім до +2 +4 °С впродовж 4–7 годин для адаптації, стабілізації і еквілібрації (врівноваження осмотично активних речовин і гліцерину між сперміями і розріджувачем). Заморожування сперми проводять на охолодженій у парах рідкого азоту (температура до –160–170 °С) фторопластовій пластині з лунками. Фасують за допомогою шприца, піпетки або спеціальної розливальної машини. Після витримування пластини з розфасованою спермою в парах азоту протягом 1–2 хвилин її занурюють у рідкий азот на 2 хвилини, а потім піднімають до верхнього рівня посудини й охолодженою лопат кою збирають гранули в пластмасові охолоджені стаканчики (контейнери), які, у свою чергу, поміщають у марлеві торбинки, фіксують і занурюють у рідкий азот для тривалого зберігання. До вільного зовнішнього кінця нитки прикріплюють етикетку з даними про бугая плідника (кличка, інвентарний номер, порода, дата одержання еякуляту та кількість доз).

Для розбавлення і заморожування сперми в облицьованих гранулах використовують лактозо жовтково цитратно гліцери нове середовище. Розрідження проводять у спермоприймачі або спеціальному пакеті. Кожну частину середовища заливають в окремі пристрої з поліетиленової плівки, які сполучені між собою еластичними трубками з патрубками циліндра дозатора. Пристрій із середовищем № 1 поміщають у термостат при температурі 35 °С, другий пристрій із середовищем № 2 – при 18–22 °С. Отриману сперму розбавляють середовищем № 1 у співвідношенні 1:1 і витримують при кімнатній температурі протягом 5–10 хвилин. Потім розбавляють її середовищем № 2 до потрібної кількості сперміїв у дозі. Сперму розфасовують у

96

полімерну трубку діаметром 3,8–4 мм з товщиною стінок 120 мкм, вкладають її в автомат ПРЖ і сполучають із муфтою спермоприймача. Весь розбавлений еякулят вдавлюється в трубку, після чого її підводять до зварювального вузла автомата, який розділяє трубку на частини із спермодозами об’ємом 0,25 – 0,33 мл з одночасною герметизацією їх країв і маркуванням доз. Спермодози з бункера автомата переносять в алюмінієві туби діаметром 40 мм, закривають паралоновими пробками і загвинчують в обойму пристрою для еквілібрації і заморожу вання сперми. Цей пристрій поміщають у холодильник і витримують при температурі +2 +4 °С протягом 4–6 год за постійного обертання обойми. Охолоджені туби знімають з апарата, кріплять до них стержні тримачі і переносять у широкогорлу посудину (“Харків 3”), заповнену рідким азотом.

Для заморожування сперми в соломинках (паєтах) за французькою технологією використовують середовище

“Лецифос” (477 і 488) та “Кріоцифос” (479 і 480).

Сухі заготовки середовища “Лецифос” розчиняють у бідистильованій воді, добавляють жовток, після чого розділяють на дві частини, у кожну з яких (№ 1 і № 2) добавляють гліцерин – відповідно 3 % і 11 %. Спочатку сперму розбавляють середовищем № 1 при температурі 32 °С й охолоджують протягом 45–50 хв до 4 °С у холодильнику або за допомогою льоду, який розстає. Охолоджену сперму розбавляють середовищем № 2 при температурі 4 °С у співвідношенні 1:1. При цьому середовище додають двома рівними порціями з інтервалом 15 хв, після чого охолодження проводять ще протягом 3 – 3,5 годин.

Розфасовують сперму в попередньо стерилізовані і марковані соломинки об’ємом 0,5 або 0,25 мл. Після їх заповнення спермою вільний кінець запаюють ультразвуком і розміщують горизонтально на спеціальну охолоджену підставку, яку переносять у посудину Дюара на металеву сітку. Температуру встановлюють –120 °С або –140 °С, відповідно для

97

пайєт 0,25 і 0,5 мл; витримують їх протягом 10–12 хвилин, а потім переносять у рідкий азот для зберігання.

Середовище “Кріоцифос” простіше за складом, аніж “Лецифос”, не містить молока, що істотно полегшує проведення оцінки сперми. У її варіант 479 додають антибактеріальні препарати: пеніцилін, стрептоміцин, лінкоміцин і спектино міцин, а у варіанті 480 – тилозин, гентаміцин, лінкоміцин, спектиноміцин.

Для розбавлення і заморожування сперми за байсогаль ською технологією використовують середовища ЛЦГЖС або ЛФРМГЖ. Свіжоотриману сперму розбавляють у співвідношенні 1:1 за температури 27±1 °С і залишають при температурі 18–20 °С на 15 хв. При цьому, як правило, використовують 20 % розрахованого об’єму середовища, а залишки додають після температурної витримки. Розбавлену сперму розфасовують у промарковані на машині М6 МНС і простерилізовані соломинки, які закупорюють з обох боків скляними кульками за допомогою автоматичного пристрою М6 МУ2 С й охолоджують протягом 3–4 год при +4 +5 °С. Заморожування проводять у два етапи: витримуванням при температурі –150–180 °С протягом 7 хвилин та наступним зануренням у рідкий азот. Зберігають пайєти у спеціальних стаканах.

Компанії IMV та MiniTube пропонують широкий вибір обладнання для атоматичного, напівавтоматичного фасування, маркування, охолодження та заморожування сперми.

Для заморожування і зберігання сперму жеребця розбав ляють середовищами ЛХЦЖ із додаванням гліцерину, Eqcellsire, Eq’cellfreeze qsp.

Розріджують еякулят одномоментно у співвідношенні 1:3. Заморожують сперму жеребця у формі відкритих гранул або пайєт об’ємом 0,25 – 0,5 мл.

Технологічний процес заморожування сперми жеребців не відрізняється від такого у бугаїв.

98

Заморожування сперми барана практикують рідше, аніж бугая. Це пов’язано з низькою заплідненістю маток внаслідок осіменіння кріоконсервованою спермою та особливостями технології осіменіння у вівчарстві і строками її застосування.

Для розрідження і заморожування доцільно використо вувати синтетичні середовища ВІКА (з антиоксидантом), ГЖЦК трисбуферну (з декстрином) та ЛЖГТЦГ (з полісахаридом гуміарабіком).

Методи заморожування сперми кнурів і тривалого її зберігання розроблені, але практичного застосування в країнах СНД не мають; у 2008–2009 рр. на декількох племпідприємствах України установлено сучасне обладнання і розпочалась робота з апробації і впровадження кріоконсервації сперми кнурів.

На пунктах штучного осіменіння сперму плідників зберігають у посудинах Дьюара СДС 50, СДС 20, “Харків 34 А” та ін. У них же і транспортують сперму.

99

2.17. ТРАНСПОРТУВАННЯ СПЕРМИ

Для транспортування сперми, яка не підлягає заморожу ванню, використовують харчові або спеціальні термоси.

Під час транспортування сперми слід дотримуватися таких вимог:

•необхідно попереджати струси термосів та слідкувати, щоб мішечки зі спермою були розміщені між шматочками льоду;

•запобігати пошкодженню термосів та посудин зі спермою; підтримувати необхідну температуру у термосах;

•забезпечити швидкість доставки сперми до місця призначенця.

У зимову пору року за низької температури навколиш нього середовища термоси поміщають у ватні або тканинні чохли для попередження замерзання сперми.

Сперму, яка зберігається за температури +18 +20 °С, тран спортують у спеціальних термосах (переносних клімат боксах).

2.18.ВИЗНАЧЕННЯ СТАТЕВОЇ ОХОТИ І ОПТИМАЛЬНОГО ЧАСУ ОСІМЕНІННЯ САМОК

Оптимальним часом для введення сперми самкам сільськогосподарських тварин є феномен стадії збудження – статева охота. Під час статевої охоти самки проявляють позитивну реакцію на самців – допускають плигання на себе і статевий акт.

Під час організації штучного осіменіння вибір статевої охоти або оптимального часу для введення сперми має надзвичайно велике значення для забезпечення заплідненості. Несвоєчасне (раннє або пізнє до часу овуляції) введення сперми, осіменіння самок поза статевою охотою та вже вагітних є поширеними помилками під час використання недосконалих

100