3.2. Лабораторная работа: «Диализ белков».

Диализом называют процесс разделения высокомолекулярных веществ (например, белков) и низкомолекулярных (например, солей) с помощью полупроницаемых мембран.

Полупроницаемыми называют мембраны, диаметр пор которых позволяет проходить только низкомолекулярным соединениям. Примером естественных полупроницаемых мембран могут быть капсулы Боумена—Шумлянского почек. Широко используют искусственные полупроницаемые мембраны: целлофан, коллодий, на основе которых созданы диализаторы, в том числе «искусственная почка».

Метод диализа используют в научных лабораториях, в промышленности, в клинической практике.

Цель работы

Доказать, что низкомолекулярное соединение NaCl проходит через полупроницаемую мембрану, а высокомолекулярный белок не проходит и остается в диализируемом растворе.

Принцип метода

Метод основан на том, что низкомолекулярные вещества легко диффундируют через полупроницаемые мембраны в чистый растворитель, образуя диализат. Диффузия будет продолжаться, пока не произойдет выравнивание концентраций диффундируемого вещества между диализируемым раствором и диализатом. Процесс возобновится, если диализат заменить чистым растворителем или, если эта смена будет происходить постоянно (проточный диализ).

Выполнение работы

Подготовка диализатора: полупроницаемой мембраной могут быть диализные трубки или целлофановые диализные мешочки. Целлофан (квадрат 10х10 см) смачивают дистиллированной водой, делают в нем углубление и получают диализный мешочек.

Приготовление диализируемого раствора: в диализный мешочек помещают 20 капель разведенного яичного белка в 5 % растворе NaCl (белок одного яйца разводят в 300 мл 5% раствора NaCl) и перемешивают. Края целлофана зажимают между двумя стеклянными палочками, скрепленными между собой резиновыми кольцами.

Диализ. Мешочек с солевым раствором белка помещают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы часть мешочка с раствором белка была полностью погружена в воду. Сразу же, на просвет можно заметить струйки солевого раствора, опускающиеся из мешочка на дно стакана, что обусловлено изменением рефракции воды.

Анализ результатов диализа. Через 60 мин после начала диализа проводят качественные пробы на белок (биуретовую реакцию) и на NaCl (с AgNO₃) в соответствии с таблицей.

Реактивы	Проба на белок в диализате	Проба на белок в диализируемой жидкости	Проба на ионы Cl- в диализате
Диализат	10 капель	–	10 капель
Диализируемый раствор	–	10 капель	–
10 % NaOH	5 капель	5 капель	–
1 % CuSO4	1 капля	1 капля	–
10 % HNO3	–	–	1 капля
1 % AgNO3	–	–	1 капля
Наблюдения

Выводы Занятие 4. Коллоквиум I по темам «Простые белки, сложные белки, нуклеиновые кислоты»

Вопросы, для самостоятельной подготовки:

1) Белки — основа живых организмов. Биологическая роль белков. Методы выделения и очистки белков. Аминокислотный состав белков. Классификация аминокислот. Характер связей остатков аминокислот в молекуле белка. Заменимые и незаменимые аминокислоты. Понятие о кормовой ценности белков. Полипептиды и их строение. Биологически активные пептиды.

2) Физико-химические свойства белков. Уровни структурной организации белков: первичная, вторичная, третичная, четвертичная cтруктуры белков. Фолдинг белковых молекул. Понятие о шаперонах. Связь структуры и функции белков.

3) Классификация белков. Простые белки: протамины и гистоны, проламины и глутелины, альбумины и глобулины.

4) Представление о химическом строении и структуре нуклеиновых кислот. Пуриновые и пиримидиновые основания; рибоза, дезоксирибоза, нуклеозиды, мононуклеотиды. Характер связи мононуклеотидов в полинуклеотидной цепи нуклеиновых кислот. Структура и функции ДНК и РНК.

5) Комплементарность азотистых оснований. Правило Чаргаффа, понятие о видовой специфичности.

Варианты письменной части коллоквиума

Вариант 1.

1. Написать формулу трипептида: глутамилпролиллизин

2. Соединить в динуклеотид: ЦМФ и ГМФ

3. Какими методами можно разделить альбумины и глобулины?

4. Как можно определить наличие в растворе: трп?

Вариант 2.

1. Написать формулу трипептида: аспартиллизилпролин

2. Соединить в динуклеотид: дЦМФ и ТМФ

3. Какими методами можно разделить казеин и продукты его гидролиза?

4. Как можно определить наличие в растворе: мет?

Вариант 3.

1. Написать формулу трипептида: пролиларгинилглутамат

2. Соединить в динуклеотид: дАМФ и ТМФ

3. Какими методами можно разделить гис и гли?

4. Как можно определить наличие в растворе: глобулинов?

Вариант 4.

1. Написать формулу трипептида: гистидиллизилсерин

2. Соединить в динуклеотид: АМФ и ГМФ

3. Какими методами можно разделить асп и арг ?

4. Как можно определить наличие в растворе: цис ?

Варианты заданий на компьютерном тестировании

Инструкция к тесту: Выбрать все правильные ответы

1. Заменимая аминокислота для человека:

   1. фенилаланин

   2. тирозин

   3. триптофан

   4. треонин

   5. метионин

2. Гидрофобная аминокислота:

   1. глутамин

   2. серин

   3. треонин

   4. фенилаланин

   5. гистидин

3. При денатурации белка не нарушаются связи:

   1. дисульфидные

   2. водородные

   3. пептидные

   4. ионные

   5. гидрофобные

4. Величина R_f при бумажной хроматографии будет наибольшей для амиинокислоты:

   1. глицина

   2. треонина

   3. серина

   4. глутамата

   5. валина

5. Отрицательно заряженной АМК является:

   1. глутамин

   2. аланин

   3. глутамат

   4. лизин

   5. триптофан

6. Биуретовая реакция не дает окраски с

   1. простыми белками

   2. дипептидами

   3. трипептидами

   4. альбуминами

   5. желатином

7. Наиболее прочные связи в молекуле белка:

   1. водородные

   2. дисульфидные

   3. пептидные

   4. ионные

   5. гидрофобные

8. Нуклеотидом является:

   1. аденин

   2. аденозингидролаза

   3. цитидин

   4. прион

   5. аденозинмонофосфат

9. В молекуле ДНК неверно:

   1. А+Ц=Г+Т

   2. А=Т

   3. Г=Ц

   4. А+Т=Г+Ц

   5. Г+А=Ц+Т

10. Молекула гемоглобина:

    1. мономер

    2. димер

    3. тример

    4. тетрамер

    5. гексамер

11. Незаменимая аминокислота для человека:

    1. аспарагин

    2. глутаминовая кислота

    3. орнитин

    4. валин

    5. цистеин

12. Денатурация белка может произойти при добавлении:

    1. конц. азотной кислоты

    2. сульфата меди

    3. азотнокислого серебра

    4. конц. КОН

    5. любого из вышеперечисленных соединений

13. Простетическая группа гликопротеинов:

    1. галактоза

    2. глюкозамин

    3. глюкуроновая кислота

    4. нейраминовая кислота

    5. все вышеперечисленные вещества

14. Нуклеиновые кислоты отличаются от белков тем, что:

    1. это высокомолекулярные соединения

    2. имеют сложную пространственную структуру

    3. поглощают свет в УФ области спектра

    4. состоят из мономеров

    5. не содержат аминокислотных остатков

15. Нуклеозидом является:

    1. цитозин

    2. урацил

    3. тимин

    4. гуанозин

    5. аденозинтрифосфат

16. Сульфгидрильную группу (тиогруппу) содержит аминокислота:

    1. аспарагин

    2. гистидин

    3. лизин

    4. цистеин

    5. глутамин

17. Методом ионообменной хроматографии нельзя разделить одну из следующих пар аминокислот:

    1. глутамат и лизин

    2. глутамат и лейцин

    3. лейцин и лизин

    4. лейцин и валин

    5. валин и глутамат

18. Денатурация белка заключается в:

    1. нарушении третичной структуры

    2. нейтрализации зарядов

    3. снятии гидратной оболочки

    4. образовании функциональных комплексов с другими белками

    5. появлении сине-фиолетового окрашивания

19. Вторичную структуру белков стабилизируют химические связи:

    1. амидные

    2. гидрофобные

    3. водородные

    4. ионные

    5. ковалентные

20. Нингидриноая реакция не дает окраски с:

    1. простыми белками

    2. дипептидами

    3. трипептидами

    4. свободными аминокислотами

    5. карбоновыми кислотами

21. Неокрашенный белок:

    1. пепсин

    2. каталаза

    3. миоглобин

    4. гемоглобин

    5. цитохром С

22. В состав РНК не входит:

1. АМФ

2. ГМФ

3. ТМФ

4. ЦМФ

5. УМФ

23. Серповидно-клеточная анемия связана с заменой в молекуле гемоглобина:

    1. глу на вал

    2. глу на асп

    3. вал на лей

    4. вал на цис

    5. гли на асп

24. Заменимая аминокислота 

    1. лейцин

    2. лизин

    3. фенилаланин

    4. пролин

    5. изолейцин

25. Гидрофобная аминокислота:

    1. серин

    2. треонин

    3. триптофан

    4. аспартат

    5. глутамин

26. Альбумины нерастворимы в:

    1. дистиллированной воде

    2. фосфатном буфере, рН 6,8

    3. насыщенном растворе хлористого натрия

    4. полунасыщенном растворе сульфата аммония

    5. насыщенном растворе сульфата аммония

27. Смесь белков с различной молекулярной массой нельзя разделить:

    1. гель-фильтрацией

    2. ионообменной хроматографией

    3. диализом

    4. электрофорезом

    5. высаливанием

28. В образовании третичной структуры белков непосредственно не участвуют связи:

    1. дисульфидные

    2. гидрофильные

    3. ионные

    4. пептидные

    5. водородные

29. Положительную ксантопротеиновую реакцию дает:

    1. цистеин

    2. метионин

    3. триптофан

    4. аргинин

    5. аспарагин

30. Молекулярную массу белков можно определить:

    1. ультрацентрифугированием

    2. диализом

    3. ионообменной хроматографией

    4. колориметрически

    5. гидролизом

31. Незаменимая аминокислота для человека:

    1. изолейцин

    2. аланин

    3. глицин

    4. цистеин

    5. тирозин

32. Гидрофильная аминокислота: 

    1. валин

    2. фенилаланин

    3. лейцин

    4. лизин

    5. изолейцин

33. К простым белкам нельзя отнести:

    1. протамин

    2. коллаген

    3. гистоны

    4. альбумины

    5. гемоглобин

34. Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют метод:

    1. гель-фильтрации

    2. электрофореза

    3. ионообменной хроматографии

    4. гидролиза

    5. все вышеперечисленные

35. Положительную реакцию Фоля дает:

    1. триптофан

    2. гистидин

    3. метионин

    4. треонин

    5. серин

36. Число белковых субъединиц в молекуле гемоглобина:

    1. одна

    2. две

    3. три

    4. четыре

    5. пять

37. Чем отличаются разные типы РНК:

    1. первичной структурой

    2. молекулярной массой

    3. последовательностью нуклеотидов

    4. функциями в клетке

    5. всеми вышеперечисленными параметрами

38. Гемопротеином не является:

    1. миоглобин

    2. цитохром С

    3. каталаза

    4. гемоглобин

    5. казеин

39. Белки с различной молекулярной массой можно разделить, используя:

    1. трихлоруксусную кислоту

    2. гидроокись натрия

    3. сульфат меди

    4. сульфат аммония

    5. все вышеперечисленные соединения

40. Олигомерные белки:

    1. состоят из нескольких пептидных цепей

    2. не содержат α-спиральных участков

    3. проходят через полупроницаемую мембрану

    4. не обладают четвертичной структурой