Принцип метода

В качестве источника нейтрального жира (триацилглицеролов - ТАГ) используют молоко. Действие фермента оценивают по скорости образования кислых продуктов расщепления (свободных высших жирных кислот - ВЖК). Для этого от общего объема смеси жира с липазой через определенные промежутки времени отбирают для титрования равные части. Титрование кислых продуктов гидролиза осуществляют раствором гидроксида натрия (индикатор – фенолфталеин):

R-COOH + NaOH → R-COONa + H₂O

Результаты выражают в миллилитрах пошедшего на титрование раствора щелочи и представляют в виде графика зависимости содержания ВЖК в пробе от времени инкубации пробы.

Выполнение работы

В два стаканчика наливают по 10 мл разбавленного водой (1:1) молока. В один из стаканчиков вносят 1 мл желчи (проба 1), в другой – 1 мл Н₂О (проба 2). Из каждой пробы отбирают в колбу для титрования по 2 мл образовавшейся смеси и титруют 0,01 М раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до появления розового окрашивания. Затем в каждую пробу добавляют по 1 мл раствора липазы (вытяжка из поджелудочной железы). Быстро перемешивают струей из пипетки и отмечают время начала реакции. Повторные титрования проводят через каждые 5 минут.

Значение титрования без липазы (время реакции “0”) вычитают из величины последующих титрований. В этом случае полученные графики пройдут через начало координат, поскольку так учитывается наличие органических и желчных кислот в молоке (исходная кислотность молока) до начала действия липазы.

Пример графика зависимости содержания свободных ВЖК от времени инкубации:

Схема определения

I. Приготовление исходной смеси (в стаканчиках)
Реактивы и этапы	Стаканчик 1	Стаканчик 2
1. Разбавленное (1:1) молоко 2. Вода 3. Желчь	10 мл - 1 мл	10 мл 1 мл -
II. Определение исходной кислотности молока
	Колба для титрования 1	Колба для титрования 2
1. Исходная смесь (отбирают аликвоту из стаканчика в колбочку для титрования) 2. Фенолфталеин (добавляют в каждую колбочку) Титруют пробы раствором NaOH (до розового цвета). Значения записывают в таблицу результатов (V0 и V0 ’).	2 мл 1-2 кап	2 мл 1-2 кап

III. Отбор смеси и титрование в присутствии липазы
К оставшейся исходной смеси в оба стаканчика быстро добавляют по 1мл липазы и отмечают время. Через 5 мин отбирают аликвоты в колбы для титрования
	Колба для титрования 1	Колба для титрования 2
1. Аликвота 2. Фенолфталеин Быстро титруют раствором NaOH (до розового цвета). Значения записывают в таблицу результатов (V и V ’) Повторные титрования проводят через каждые 5 мин и результаты заносят в следующую таблицу.	2 мл 1-2 кап	2 мл 1-2 кап

Оформление результатов

V(NaOH), мл t, мин	проба № 1 (с желчью)		проба № 2 (без желчи)
	V	V-V0	V’	V’-V0 ’
0 (определение исходной кислотности молока)	V0 =	0	V0 ’=	0
5	V =		V’=
10
15
20
		по получен-ным данным строят кинетическую кривую № 1		по получен-ным данным строят кинетическую кривую № 2

Выводы