Цель работы

Освоить работу фотоэлектроколориметра (ФЭК). Научиться строить стандартные калибровочные кривые и определить содержание белка в растворе с неизвестной концентрацией.

Принцип метода

Биуретовый метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди в щелочной среде (биуретовая реакция). Интенсивность развивающейся окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка и определяется фотометрически. Для количественного определения белка измеряют интенсивность окраски стандартных растворов белка с известной концентрацией (величину оптической плотности Dст). По полученным данным строят график зависимости оптической плотности окрашенных растворов от концентрации в них белка (стандартную калибровочную кривую). На оси ординат всегда откладывают величину D как функцию от задаваемых значений (см. рисунок).

Измеряют оптическую плотность Dх окрашенного раствора с неизвестной концентрацией белка и по стандартной кривой определяют в нем концентрацию белка. В качестве стандартного белка обычно используют раствор сывороточного альбумина.

Выполнение работы (см. Приложение)

Реактивы, мл	Контроль	Стандартный белок 10 мг/мл		Стандартный белок 20 мг/мл		Стандартный белок 30 мг/мл	Неизвестный белок Х мг/мл
Раствор сывороточного альбумина	—	0,2		0,2		0,2	0,2
Н2О	0,2	—		—		—	—
Биуретовый реактив*	5	5		5		5	5
Перемешивают и инкубируют 30 минут при комнатной температуре
Фотометрируют против Н2О ( = 545 нм, толщина кюветы 1 см). D545
Dст - Dк

*Биуретовый реактив: исходный концентрат (медь сернокислая – 120 ммоль/л, калий иодистый – 300 ммоль/л, калий-натрий виннокислый – 320 ммоль/л, гидроксид натрия –3 моль/л) разводят перед работой 1:19

Оформление работы

В рабочей тетради записать и заполнить таблицу; построить стандартную кривую и определить по ней концентрацию белка в неизвестном растворе.

Выводы Занятие 16.

16.1. Семинар по теме «Обмен белков и аминокислот»

Тестовые задания по теме: «Обмен аминокислот»

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-).

1. Гистидин в печени способен дезаминироваться по внутримолекулярному типу.

2. Восстановленные коферменты оксидаз аминокислот могут непосредственно окисляться молекулярным кислородом.

3. Коферментом моноаминоксидаз (МАО) служит ФАД.

4. Декарбоксилирование аминокислот является необратимым процессом.

5. Аммиак образуется при любом типе дезаминирования аминокислот.

6. Обладает ли гистамин сосудосуживающим действием?

7. Является ли дофамин предшественником норадреналина?

8. Возможно ли декарбоксилирование 5-окситриптофана в организме человека?

9. Может ли из аланина образоваться глюкоза в организме человека и животных?

10. Относится ли лейцин к кетогенным аминокислотам?