Занятие 6.

6.1 Семинар «Ферменты» (продолжение)

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-)

1. Связано ли действие некоторых лекарственных препаратов с ингибированием отдельных ферментов?

2. Все ферменты состоят из субъединиц.

3. Константа Михаэлиса выражается в единицах концентрации субстрата.

4. Изоферменты катализируют одну и ту же химическую реакцию.

5. Первая цифра в шифре фермента обозначает, к какому классу он относится.

6. Осуществляют ли лигазы расщепление соединений по двойным связям?

7. Существуют ли мультиферментные комплексы?

8. Изменяется ли константа Михаэлиса в присутствии конкурентного ингибитора?

9. Всегда ли ингибирование фермента необратимо?

10. Используют ли препараты очищенных ферментов в терапевтических целях?

2.Вопросы с выборочным ответом

Фермент, не относящийся к гидролазам: амилаза трипсин каталаза холинэстераза пепсин

Конкурентные ингибиторы: повышают КМ фермента понижают КМ фермента повышают Vmax понижают Vmax не изменяют КМ и Vmax

6.2. Лабораторная работа: «Определение активности амилазы в моче крупного рогатого скота» по Вольгемуту.

-Амилаза (К.Ф. 3.2.1.1) – фермент, катализирующий гидролитическое расщепление 1,4--гликозидных связей в молекулах крахмала и гликогена.

В организме человека основными источниками -амилазы являются поджелудочная железа и слюнные железы, в которых существует 2 семейства изоферментов амилазы, соответственно P и S.

Изоферменты P – образуются только в поджелудочной железе. Изоферменты S – преимущественно в слюнных железах, а также в других органах и тканях. Доля изоферментов P в общей активности -амилазы значительно выше в моче, чем в сыворотке крови.

Резкое (в 10-30 раз) повышение содержания (и соответственно активности) -амилазы в сыворотке крови и в моче наблюдается при остром панкреатите (в первые сутки).

Цель работы

Определить активность -амилазы в моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

Существует много разных методов определения активности -амилазы. Мы познакомимся с простым и надежным методом последовательных разведений фермента, предложенным еще в 1929 г. Вольгемутом и сохранившемся до настоящего времени. Метод основан на определении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала (отсутствие цветной реакции с иодом) при заданных условиях.

Выполнение работы

Получение последовательных разведений мочи: в 6 пробирок наливают по 1 мл 0,85% раствора NaCl. В первую пробирку вносят 1 мл мочи (тщательно перемешивают). 1 мл смеси из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают. 1 мл из второй пробирки переносят в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки, после перемешивания, 1 мл выливают в раковину. В результате получают ряд последовательных разведений мочи:1:2; 1:4; 1:8;1:16 и т.д.

№ пробы	1	2	3	4	5	6
Разведение	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Окраска
Чем обусловлена окраска

Во все пробирки быстро вносят по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляют по 1 капле 1% раствора йода и тщательно перемешивают. Окраску раствора в пробирках заносят в таблицу.

Отмечают последнюю пробирку, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание с иодом) и рассчитывают активность -амилазы.