Тема 3 – Спектроскопический и спектрофотометрический методы анализа карбоксигемоглобина в крови. Принцип метода.

Цель: Ознакомление студентов со спектроскопическими и спектрофотометрическими методами анализа карбоксигемоглобина в крови.

Задачи обучения: сформировать у студентов знания по спектроскопическому и спектрофотометрическому методам анализа карбоксигемоглобина в крови.

Форма проведения: углубленное изучение темы и групповое обсуждение с презентацией.

Задания по теме – презентация спектроскопическихи спектрофотометрических методов анализа карбоксигемоглобина в крови.

Раздаточный материал

Спектроскопический метод обнаружения оксида углерода (II) в крови (Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия.- Выша школа.-Киев.-1989.-С.415-424)

В крови лиц, отравленных оксидом углерода (II), не весь гемоглобин превращается в карбоксигемоглобин. Смерть насту­пает значительно раньше, чем достигается полное превращение оксигемоглобина в карбоксигемоглобин.

Карбоксигемоглобин можно обнаружить в крови спектроско­пом, который является прибором для визуального спектрального определения ряда веществ, в том числе и карбоксигемоглобина.

При рассматривании крови спектроскопом наблюдаются линии и полосы, позволяющие сделать вывод о наличии или отсутствии карбоксигемоглобина.

Подлежащую исследованию кровь разбавляют водой до тех пор, пока не будет получен раствор, имеющий светло-розовую окраску. При спектроскопическом исследовании этого раствора четко видны соответствующие спектральные полосы.

Спектр оксигемоглобина крови ОНЬ имеет две полосы погло­щения между линиями Фраунгофера D и Е при длинах волн 577—589 и 536—556 нм. Спектр карбоксигемоглобина СОНЬ име­ет две полосы поглощения при длинах волн 564—579 и 523—536 нм.

После прибавления одного объема свежеприготовленного раствора сульфида аммония (NH₄)₂S или других восстановителей (дитионит натрия Na₂S₂O₄-21-^0 и др.) к четырем объемам вод­ного раствора исследуемой крови оксигемоглобин (ОНЬ) превра­щается в дезоксигемоглобин НЬ, в спектре которого имеется одна широкая полоса поглощения при 543—596 нм. Карбоксигемогло­бин не восстанавливается сульфидом аммония и другими восста­новителями. Поэтому после прибавления восстановителей полосы поглощения карбоксигемоглобина не исчезают.

Таким образом, после прибавления раствора сульфида аммо­ния к крови, содержащей окси- и карбоксигемоглобин, сохраня­ются две полосы поглощения карбоксигемоглобина, но исчезают полосы поглощения оксигемоглобина, а вместо них появляется широкая полоса поглощения дезоксигемоглобина. По наличию соответствующих полос поглощения в спектре крови делают вы­вод об отравлении оксидом углерода (II).

Спектральный метод оправдывает себя при исследовании крови, содержащей 10—30 % карбоксигемоглобина.

Оптические методы (Калетина Н.И.-Метаболизм и определение токсиканто.-М.-ГЭОТАР-Медиа.-2008.-С. 753-759)

Объектами исследования на СО являются главным образом кровь пострадавшего и воздух производственных или жилых помещений, содержащий СО.

Диагностическое значение имеет определение НЬСО в крови, взятой непосредственно на месте происшествия, так как при оказании пострадавшему первой помощи происходит час­тичная элиминация угарного газа и снижается содержание НЬСО в крови. Спектрофотометрический метод определения СО наиболее распространен, потому что все гемоглобиновые структуры имеют абсорбцию в определенной части спектра.

Метод Рооке является наиболее подходящим при определении низких концентраций НЬСО. Он основан на сравнении спектров поглощения восстановленного гидросульфитом натрия НЬ и НЬСО. который не реагирует с гидросульфитом натрия. Спектры снимают после разбавления крови (0.1 мл) раствором аммиака (50 мл). Измеряют абсорбцию НЬ и НЬСО при 420 и 432 нм. Предварительно определяют молярный коэффициент экстинкции при 420 и 432 нм. При 420 нм абсорбция НЬСО в 2 раза превышает абсорбцию НЬ. а при 432 нм абсорбция НЬ почти в 3 раза больше абсорбции НЬСО. Разница между абсорбцией НЬ и НЬСО при 420 и 432 нм ис­пользуется при расчете содержания НЬСО по определенной формуле. Метод Рооке несколько громоздок в подготовительной части и математических расчетах, но полученные результаты обычно точны и воспроизводимы.

Спектроскопический метод. В основу спектроскопического (микроспектрального) анализа положено свойство гемоглобина и его производных поглощать свет определенной длины вол­ны, поэтому при прохождении луча света через растворы, содержащие гемоглобин пли его про­изводные, в спектре появляются темные полосы поглощения, расположенные в определенной части спектра для каждого производного гемоглобина.

В судебно-медицинской практике для этого пользуются микроспектроскопами — прибора­ми, представляющими собой спектроскоп, соединенный с окуляром.

Оксигемоглобин (НЬО) имеет в видимой части спектра две полосы поглощения при λ 589— 577 и λ 556—536 нм, восстановленный гемоглобин (НЬ) имеет одну полосу поглощения при λ 596—543 нм, НЬСО — 2 полосы при λ 579—564 и λ 536—523 нм.

Кровь для исследования разбавляют водой до тех пор. пока не будут видны при спектро­скопическом исследовании две полосы поглощения в желтой и зеленой частях спектра, между линиями Фраунгофера О и Е. Эти линии соответствуют НЬО. При добавлении к жидкости свежеприготовленного (Гм'Н₄),8 происходит восстановление НЬО в редуцированный гемогло­бин; спустя некоторое время вместо двух полос поглощения появляется одна более широкая полоса, лежащая между двумя ранее бывшими полосами. При спектроскопическом исследо­вании крови, содержащей СО, также видны две полосы поглощения, принадлежащие НЬСО. При сравнении полученного спектра НЬСО со спектром НЬО оказывается, что эти полосы по своему расположению не совпадают. Добавление сульфида аммония не вызывает восстановле­ния НЬСО. и две полосы поглощения НЬСО не исчезают.

При отравлениях не происходит полного насыщения крови СО так как смерть наступает раньше, чем оно произойдет. Поэтому в крови трупа наряду с НЬСО имеется некоторое количес­тво НЬО. После добавления сульфида аммонии при сохранившихся двух полосах НЬСО между ними появляется большее или меньшее затемнение — полоса восстановленного гемоглобина.

Количественное определение в крови НЬСО колориметрическим методом (модифицированный метод Вольфа). Этот метод основан на том, что при рН 4,95. температуре 55—60 "С, за 10— 15 мин НЬО. в отличие от НЬСО, выпадает в осадок. Для осаждения НЬСО требуется больше времени. Таким образом, эти два вещества отделяют и НЬСО определяют колориметрически. Строят калибровочную кривую, используя растворы разной степени разведения из образца крови с известным содержанием гемоглобина. Исследуемый образец крови разбавляют 50— 100 раз измеряют светопоглощение и по калибровочной кривой находят концентрацию гемог­лобина. Процент насыщения гемоглобина СО определяют по соответствующей формуле.

Следует отметить, что метод Вольфа можно использовать для определения СО только в самое ближайшее время после смерти от отравления СО, так как при длительном посмертном сроке белковая часть молекулы меняется, что влияет на растворимость гемопротеинов окси - и НЬСО.

Спектрофотометрическии метод Фревурста — Майнеке основан на определении поглоще­ния света определенной длины волны (X 575 или 578 нм) раствором гемолизованной крови до и после восстановления НЬО гидросульфитом натрия. При 100% насыщении крови СО вели­чина поглощения света после добавления гидросульфита натрия не меняется. При неполном насыщении или отсутствии СО она уменьшается. По степени этого уменьшения определяют процент НЬСО в исследуемом образце.

Клинические химические лаборатории обычно оснащены автоматизированными дифферен­циальными спектрофотометрами (СО-оксимеграми). которые одновременно измеряют опти­ческую плотность гемолизированной крови на 4 и более длинах волн для определения общего гемоглобина, процентного содержания НЬО, НЬСО, метгемоглобина и сульфагемоглобина (см. гл. 2.4).

Количественное определение в крови НЬСО спектрофотометрическим методом

При добавлении восстановителя (натрия тиосульфата) к исследуемой крови окси- и мет-гемог.тобин количественно образуют восстановленную форму гемоглобина. Последняя имеет спектр поглощения, представленный на рис. 8-16, Б.

СО имеет большее сродство к гемоглобину, чем кислород, поэтому комплекс НЬСО не можег быть разрушен тиосульфатом натрия. Таким образом, после обработки тиосульфатом натрия комплекс НЬСО проявляется характерным спектром с двумя максимумами поглоще­ния (рис. 8-16, А). Максимальная разница оптической плотности между спектрами А и Б от­мечается при длине волны 540 нм, тогда как при длине волны 579 нм оптическая плотность практически одинакова. Процентное содержание СО в крови (см. рис. 8-16. А) может быть вычислено по формуле, исходя из значения оптической плотности «здоровой», не содержащей НЬСО крови (см. рис. 8-16. Б), и исследуемого образца (см. рис. 8-16. В) после добавления тиосульфата натрия:

где х — оптическая плотность.

Рис. 8-16. Уф-спектры НЬСО (А), восстановленного гемоглобина (Б) и крови паписта при отравлении угарным газом ( В).

Интерпретация результатов

• Содержание СО в крови < 5%: норма; для курящих до 10%.

• Содержание СО в крови 10—20%: интоксикация легкой степени.

• Содержание СО в крови 20—30%: интоксикация средней степени.

• Содержание СО в крови 30—40%: интоксикация средней степени, но возможен коллапс.

• Содержание СО в крови 40—50%: интоксикация средней степени, выраженные расстройс­тва дыхания и функций сердечно-сосудистой системы, часто коллапс, возможна смерть.

• Содержание СО в крови 50—60%: интоксикация сильной степени — кома, судороги, воз­можна смерть.

• Содержание СО в крови 60—90%: смерть (см. также гл. 2.4.3).

Литература

1. Токсикологическая химия: метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие + СD/ под ред. Н.И. Калетиной. – М., 2008. – 1016 с. Переплет.

2. Токсикологическая химия: учебник / под ред. Т.В. Плетеневой. – 2-ое изд. – М., 2008. – 512 с. Переплет.

3. Лужников Е.А. Клиническая токсикология. -М.,"Медицина", 1994. –189с.

Контрольные вопросы

1. Оптические методы обнаружения оксида углерода (II) в крови.

2. Спектроскопический метод обнаружения оксида углерода (II) в крови.

3. Метод Рооке - при определении низких концентраций НbСО.

4. Количественное определение в крови НbСО колориметрическим методом (модифицированный метод Вольфа).

5. Спектрофотометрический метод Фревурста — Майнеке

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ