Методические рекомендации для занятий (практические, семинарские, лабораторные)

Тема 3 - Решение экспертной задачи по проведению направленного ,химико-токсикологического анализа на карбоксигемоглобин:

- подготовка проб к анализу;

- обнаружения в трупной крови карбоксигемоглобина с использованием химических и физико-химических методов анализа

Цель: ознакомить студентов со схемой направленного ,химико-токсикологического анализа на карбоксигемоглобин.

Задачи обучения: научить студентов методам подготовки проб к анализу и обнаружения в трупной крови карбоксигемоглобина с использованием химических и физико-химических методов анализа.

Форма проведения: семинар, работа в малых группах и выполнение заданий парами студентов.

Задания по теме:

Задание 1 групповое обсуждение теоретических вопросов по теме занятия.

1. Методы определения оксида углерода (II) в биообъектах.

2. Подготовка проб к анализу

3. Предварительные методы исследования (химические)

4. Обнаружения в трупной крови карбоксигемоглобина с использованием химических методов анализа

5. Обнаружения в трупной крови карбоксигемоглобина с использованием физико-химических методов анализа

Задание 2. (для 2-х студентов).

Токсикологическая химия. Ситуационные задачи и упражнения. Под ред.Н.И. Калетиной.-М.-2007.-С.314. Ситуационная задача № 9

На ХТЭ доставлены: внутренние органы, моча и кровь трупа.

Обстоятельства дела.

Во время сильного пожара в дачном поселке пропал человек. На месте происшествия его останков не было обнаружено. Однако через 3 дня труп был найден в закрытом снаружи и слегка обгоревшем сарае.

Информация.

Патологоанатомом при осмотре трупа отмечены отек легких и мозга, слизь в бронхах, сине-багровый цвет кожи и малиново-красный оттенок слизистых оболочек.

При исследовании крови трупа был обнаружен токсикант. В пробах с основным ацетатом свинца и формалином кровь потерпевшего сохра­няла розовый цвет.

Цель исследования: провести направленный химико-токсикологический анализ на карбоксигемоглобин, представленных биообъектов.

Приведите схему химико-токсикологического анализа представленных биообъектов, опираясь на методологию системного химико-токсикологи­ческого анализа (СХТА).

Лаборатория работает согласно принципам GLP и оснащена аналити­ческим оборудованием в соответствии с современными рекомендациями TIAFT.

ПРИМЕЧАНИЕ

При решении задачи следует:

• представить информацию о выборе биообъекта, используя знания фи­зико-химических свойств токсикантов, их токсикокинетики и мета­болизма;

• представить информацию о способе подготовки проб к анализу и обнаружения в трупной крови карбоксигемоглобина с использованием химических и физико-химических методов анализа, учитывая Ваш выбор последующих методов анализа;

• выбрать методы идентификации и количественного определения ток­сикантов, учитывая их чувствительность и специфичность, преиму­щества и недостатки;

• обосновать выбор способа количественного определения, поэтапно изложить схему и процедуру его проведения, привести математичес­кие формулы; если необходимо, то произвести вычисления;

• представить интерпретацию полученных количественных результатов;

• дать заключение об обнаружении токсикантов.

Литература

Основная:

1. Токсикологическая химия: метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие + СD/ под ред. Н.И. Калетиной. – М., 2008. – 1016 с. Переплет.

2. Токсикологическая химия: учебник / под ред. Т.В. Плетеневой. – 2-ое изд. – М., 2008. – 512 с. Переплет.

3. Лужников Е.А. Клиническая токсикология Е.А. Лужников.-М.,"Медицина", 1994. –189 с.

4. Крамаренко В. Ф. Токсикологическая химия / В. Ф. Крамаренко. - Киев, «Высшая школа», 1989.- 272 с.

Контрольные вопросы:

1. Методы определения оксида углерода (II) в биообъектах.

2. Подготовка проб к анализу

3. Предварительные методы исследования (химические)

4. Обнаружения в трупной крови карбоксигемоглобина с использованием химических методов анализа

5. Обнаружения в трупной крови карбоксигемоглобина с использованием физико-химических методов анализа

ПРИЛОЖЕНИЕ

Cпектроскопический метод обнаружения оксида углерода (II) в крови (Крамаренко В.Ф. Токс.химия.- Выша школа.-Киев.-1989.-С.415-424)

В крови лиц, отравленных оксидом углерода (II), не весь гемоглобин превращается в карбоксигемоглобин. Смерть насту­пает значительно раньше, чем достигается полное превращение оксигемоглобина в карбоксигемоглобин.

Карбоксигемоглобин можно обнаружить в крови спектроско­пом, который является прибором для визуального спектрального определения ряда веществ, в том числе и карбоксигемоглобина.

При рассматривании крови спектроскопом наблюдаются линии и полосы, позволяющие сделать вывод о наличии или отсутствии карбоксигемоглобина.

Подлежащую исследованию кровь разбавляют водой до тех пор, пока не будет получен раствор, имеющий светло-розовую окраску. При спектроскопическом исследовании этого раствора четко видны соответствующие спектральные полосы.

Спектр оксигемоглобина крови ОНb имеет две полосы погло­щения между линиями Фраунгофера D и Е при длинах волн 577—589 и 536—556 нм. Спектр карбоксигемоглобина СОНb име­ет две полосы поглощения при длинах волн 564—579 и 523—536 нм.

После прибавления одного объема свежеприготовленного раствора сульфида аммония (NH₄)₂S или других восстановителей (дитионит натрия Na₂S₂O₄-21-0 и др.) к четырем объемам вод­ного раствора исследуемой крови оксигемоглобин (ОНb) превра­щается в дезоксигемоглобин Нb, в спектре которого имеется одна широкая полоса поглощения при 543—596 нм. Карбоксигемоглобин не восстанавливается сульфидом аммония и другими восста­новителями. Поэтому после прибавления восстановителей полосы поглощения карбоксигемоглобина не исчезают.

Таким образом, после прибавления раствора сульфида аммо­ния к крови, содержащей окси- и карбоксигемоглобин, сохраня­ются две полосы поглощения карбоксигемоглобина, но исчезают полосы поглощения оксигемоглобина, а вместо них появляется широкая полоса поглощения дезоксигемоглобина. По наличию соответствующих полос поглощения в спектре крови делают вы­вод об отравлении оксидом углерода (II).

Спектральный метод оправдывает себя при исследовании крови, содержащей 10—30 % карбоксигемоглобина.

Оптические методы (Калетина Н.И.-Метаболизм и определение токсикантов.-М.-2007.-С.-753-759 )

Объектами исследования на СО являются главным образом кровь пострадавшего и воздух производственных или жилых помещений, содержащий СО.

Диагностическое значение имеет определение НbСО в крови, взятой непосредственно на месте происшествия, так как при оказании пострадавшему первой помощи происходит час­тичная элиминация угарного газа и снижается содержание НbСО в крови. Спектрофотометрический метод определения СО наиболее распространен, потому что все гемоглобиновые структуры имеют абсорбцию в определенной части спектра.

Количественное определение в крови НbСО спектрофотометрическим методом

При добавлении восстановителя (натрия тиосульфата) к исследуемой крови окси- и метгемоглобин количественно образуют восстановленную форму гемоглобина. Последняя имеет спектр поглощения, представленный на рис. 1.

СО имеет большее сродство к гемоглобину, чем кислород, поэтому комплекс НbСО не можег быть разрушен тиосульфатом натрия. Таким образом, после обработки тиосульфатом натрия комплекс НbСО проявляется характерным спектром с двумя максимумами поглоще­ния (рис. 8-16, А). Максимальная разница оптической плотности между спектрами А и Б от­мечается при длине волны 540 нм, тогда как при длине волны 579 нм оптическая плотность практически одинакова. Процентное содержание СО в крови (см. рис. 1. А) может быть вычислено по формуле, исходя из значения оптической плотности «здоровой», не содержащей НbСО крови (см. рис. 1. Б), и исследуемого образца (см. рис. 1. В) после добавления тиосульфата натрия:

Рис. 1. Уф-спектры НЬСО (А), восстановленного гемоглобина (Б) и крови паписта при отравлении угарным газом ( В).

Интерпретация результатов

• Содержание СО в крови < 5%: норма; для курящих до 10%.

• Содержание СО в крови 10—20%: интоксикация легкой степени.

• Содержание СО в крови 20—30%: интоксикация средней степени.

• Содержание СО в крови 30—40%: интоксикация средней степени, но возможен коллапс.

• Содержание СО в крови 40—50%: интоксикация средней степени, выраженные расстройс­тва дыхания и функций сердечно-сосудистой системы, часто коллапс, возможна смерть.

• Содержание СО в крови 50—60%: интоксикация сильной степени — кома, судороги, воз­можна смерть.

• Содержание СО в крови 60—90%: смерть

Газохромотографический метод

Газовая хроматография является достаточно простым и прямым методом определения об­щего количества СО в крови. Высвобождение СО из НbСО крови достигается обычно добав­лением растворов натрия карбоната или некоторых других веществ. Газовая фаза вводится в хроматограф, снабженный детектором по теплопроводности. Концентрация СО определяется по калибровочному графику после расчета площади пика. Результаты метода достоверны при концентрации НbСО 30—100%. Ошибка при использовании метода составляет 10%.

Другой вариант газохроматографического определения СО в крови основан на переведении его в метан или С0₂ за счет каталитического восстановления водородом или окисления на силикагеле с пятиокисью йода.

В первом случае после высвобождения СО из крови в реакторе-дозаторе гелием газовую смесь мгновенно выталкивают из реактора в хроматографическую колонку, где СО каталити­чески восстанавливается водородом до метана и регистрируется ПИД.

Во втором случае С0₂ и СО разделяются на одной колонке с силикагелем, а затем в ячейке с пятиокисью йода СО окисляется до СО, и последний регистрируется детектором. Разница ве­личин интенсивности пиков до и после окисления позволяет установить концентрацию СО.