Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных забо-

леваний.

Вопросы генотерапии наследственных заболеваний подробно

рассмотрены в многочисленных обзорах (Ledley, 1987; Ander-

son, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein,

1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дризе, 1994; Crys-

tal, 1995) и достаточно полно суммированы в недавно опубли-

кованной монографии (Culver, 1994).

Уже через год после первого введения маркерного гена в

организм человека была проведена успешная клеточная сомати-

ческая генотерапия наследственного заболевания, обусловлен-

ного дефицитом аденозиндезаминазы (ADA) (см. 9.1). При этом

заболевании в крови пациентов накапливается в высокой кон-

центрации 2'-дезоксиаденозин, оказывающий токсическое дейс-

твие на T- и B- лимфоциты, в результате чего у больных раз-

вивается серьезный комбинированный иммунодефицит. Для под-

держания жизни пациентов проводят переодические гетерологич-

ные трансплантации клеток костного мозга, однако, лишь для

трети больных могут быть подобраны совместимые доноры. Эн-

зим-замещающая терапия также приводит к заметному улучшению

состояния пациентов, но, как правило, успех этот носит вре-

менный характер. План генной терапии, разработанный сотруд-

никами Национального Института Здоровья США (NIH) и одобрен-

ный RAC, заключался в назначении больным аутологичных лимфо-

цитов, трансдуцированных нормальным ADA-геном. Осуществление

этого плана потребовало выполнения следующих процедур: изо-

ляции клеток из крови пациента; активации и иммуностимуляции

роста T-лимфоцитов в культуре; трансдукции их ретровирусным

вектором, несущим нормальный ADA-ген и маркерный ген neo;

отбора трансдуцированных клеток на селективной среде; внут-

ривенной реинфузии модифицированных T-лимфоцитов пациенту.

Первой пациенткой, подвергшейся этой терапии, была 4-х лет-

няя девочка (см.раздел 9.1). На протяжении 10.5 месяцев ей

было сделано 8 аутологичных вливаний трансдуцированных

T-лимфоцитов и после полугодового перерыва программу реинфу-

зий повторяли каждые 3-5 месяцев. Уже после первого цикла

число T-лимфоцитов нормализовалось, концентрация ADA в цир-

кулирующих клетках крови увеличилась с 1% до 20 - 25% нор-

мального уровня и резко улучшились основные иммунные харак-

теристики. Вопреки многим прогнозам, на протяжении более,

чем 6 месяцев после прекращения массированных вливаний в

кроветоке пациентки устойчиво сохранялось высокое число кор-

ректированных T-клеток, что позволило в дальнейшем снизить

количество вводимых клеток и значительно увеличить промежут-

ки между этими процедурами. Спустя три месяца после первых

клинических испытаний была начата программа генной терапии

ADA-дефицита у второй 9-летней пациентки. После 11 инфузий

трансдуцированных аутологичных T-клеток состояние этой де-

вочки также заметно улучшилось и отмечалась полная нормали-

зация соответствующих биохимических и иммунологических пока-

зателей. Таким образом, необходимо еще раз отметить, что при

лечении обеих пациенток был достигнут очевидный клинический

эффект (Anderson,1992; Culver, 1994).

Однако, в обоих случаях не все иммунные функции восста-

навливались полностью. По-видимому, это было связано с тем,

что коррекция генетического дефекта проводилась в зрелых

T-лимфоцитах. В связи с этим предложены программы генной те-

рапии с помощью реинфузии смешанной популяции трансдуциро-

ванных T-лимфоцитов и перефирических стволовых клеток крови.

Возможность изоляции и трансдукции таких тотипатентных ство-

ловых клеток показана в экспериментах на приматах.

Успех первых клинических испытаний явился мощным стиму-

лом для ускорения развития новых генотерапевтических методов

применительно к другим наследственным заболеваниям. В

Табл. 92 представлен список болезней, для которых принципи-

ально возможен генотерапевтический подход и генокоррекция

наследственного дефекта с большой вероятностью будет осу-

ществлена уже в обозримом будущем, а также те заболевания,

для которых уже имеются официальныо утвержденные протоколы и

которые находятся на разных стадиях клинических испытаний.

Таблица 9.2. Наследственные заболевания, генокоррекция кото-

рых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспери-

ментальных разработок (ЭР) и принципиально возможна (ПВ).

(Сulver, 1994; Lowenstein, 1994)

---T----------------T-----------------------T----------------T----¬

¦ ¦Болезнь ¦ Дефектный ген ¦ Клетки-мишени ¦Ста-¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦дия ¦

+--+----------------+-----------------------+----------------+----+

¦1 ¦Иммунодефицит ¦аденозиндезаминаза ¦лимфоциты ¦ КИ ¦

¦2 ¦Иммунодефицит ¦пуриннуклеозид- ¦лимфоциты ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦фосфорилаза ¦ ¦ ¦

¦3 ¦Семейная гипер- ¦рецептор липопротеинов ¦гепатоциты ¦ КИ ¦

¦ ¦холистеринемия ¦низкой плотности ¦ ¦ ¦

¦4 ¦Гемофилия В ¦фактор 1Х ¦фибробласты ¦ КИ ¦

¦5 ¦Гемофилия А ¦фактор Y111 ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦ ¦ ¦фибробласты ¦ ¦

¦6 ¦Болезнь Гоше ¦в-глюкоцереброзидаза ¦макрофаги, ¦ КИ ¦

¦ ¦(сфинголипидоз) ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦7 ¦Болезнь Хантера ¦идуронат-сульфатаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦8 ¦Синдром Гурлера ¦L-идуронидаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦ ¦стволовые клетки¦ ¦

¦9 ¦Эмфизема легких ¦альфа-1-антитрипсин ¦лимфоциты ¦ ЭР ¦

¦10¦Муковисцидоз ¦CF-трансмембранный ¦эпителий бронхов¦ КИ ¦

¦ ¦ ¦регулятор ¦ ¦ ¦

¦11¦Фенилкетонурия ¦фенилаланингидроксилаза¦гепатоциты ¦ ЭР ¦

¦12¦Гипераммонемия ¦орнитинтранскарбамилаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦

¦13¦Цитрулинемия ¦аргиносукцинатсинтетаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦

¦14¦Мышечная дист- ¦дистрофин ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦рофия Дюшенна ¦ ¦миофибриллы ¦ ¦

¦15¦Талассемия ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦

¦16¦Серповиднокле- ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЭР ¦

¦ ¦точная анемия ¦ ¦ ¦ ¦

¦17¦Респираторный ¦сурфактант ¦эпителий бронхов¦ ЭР ¦

¦ ¦дистресс-синдром¦белок В ¦ ¦ ¦

¦18¦Хронический ¦NADPH-оксидаза ¦гранулоциты ¦ ЭР ¦

¦ ¦грануломатоз ¦ ¦ ¦ ¦

¦19¦Болезнь ¦белок-предшественник ¦нервные клетки ¦ ЭР ¦

¦ ¦Альцгеймера ¦в-амилоида (ААР) ¦ ¦ ¦

¦20¦Болезнь ¦тирозин-гидроксилаза ¦миобласты, ¦ ЭР ¦

¦ ¦Паркинсона ¦ ¦фибробласты ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦

¦21¦Метахромати- ¦арилсульфатаза А ¦стволовые клетки¦ ПВ ¦

¦ ¦ческая лейко- ¦ ¦крови, ¦ ¦

¦ ¦дистрофия ¦ ¦нервные клетки ¦ ¦

¦22¦Синдром Леш- ¦гипоксантин-фосфо- ¦нервные клетки ¦ ПВ ¦

¦ ¦Нихана ¦рибозил трансфераза ¦ ¦ ¦

L--+----------------+-----------------------+----------------+-----

Как следует данных Таблицы 9.2, на стадии клинических

испытаний в 1994г. уже находились 5 моногенных заболеваний.

Для 10 генных болезней проводились экспериментальные иссле-

дования и отрабатывались требования, необходимые для получе-

ния официального разрешения клинических испытаний (см.9.1).

Исследования по остальным заболеваниям находятся на началь-

ных этапах. Список таких заболеваний очень быстро увеличива-

ется. Обращает на себя внимание, что первые программы по

генной терапии связаны с модификацией гемопоэтических клеток

(Wivel, Walters, 1993). Клетки крови наиболее доступны для

генетических манипуляций. После изоляции различные типы кле-

ток крови могут быть легко размножены, подвергнуты трансфек-

ции in vitro, а затем возвращены пациенту. Генетической мо-

дификации могут быть подвергнуты не только зрелые клетки

(лимфоциты, макрофаги), но и их предшественники - стволовые

клетки. Важным обстоятельством, в этой связи, является то,

что процедура трансплантации клеток костного мозга уже широ-

ко используется в клинике. Разработаны и достаточно эффек-

тивные методы выделения стволовых гемопоэтических клеток че-

ловека (Berardi etal.,1995). В экспериментах на животных по-

казано, что модифицированные клетки как миелоидного, так и

лимфоидного рядов могут сохраняться в кровотоке на протяже-

нии более двух лет после аутологичной пересадки клеток кост-

ного мозга, трансдуцированных in vitro. Путем трансфекции

клеток крови соответствующими генами можно лечить не только

собственно заболевания крови, но и использовать их для лече-

ния многих других заболеваний как моногенной природы

(Табл. 9.2), так и различных опухолей и инфекций (см.ниже).

Другими достаточно универсальными реципиентами чужерод-

ных генов могут быть фибробласты и мышечные клетки (миоблас-

ты, миофибриллы). Они могут быть использованы для тех забо-

леваний, где необходима коррекция генов, белковые продукты

которых должны поступать в сыворотку крови или дифундировать

в соседние клетки. Особенно удобны для целей генной терапии

скелетные мышцы, в которых благодаря отсутствию эндонуклеаз-

ной активности (см.раздел 9.4.2) принципиально возможен пе-

ренос генов in vivo путем прямой иньекции экзогенной ДНК.

Инъецированная в мышцы ДНК способна экспрессироваться в мио-

фибриллах находясь в неинтегрированном, эксрахромосомном

состоянии. Белковые продукты экспрессии в течение длительно-

го времени после трансдукции будут поступать в кровь. Про-

должительность экспрессии значительно увеличивается, если

генетическую модификацию производят в аутологичных миоблас-

тах, которые после этого инъецируют в зрелую мышцу. Эти осо-

бенности уже позволили начать эксперименты по генной терапии

таких заболеваний как гемофилии А и В, дефицит антитрипсина,

диабет, врожденный дефицит гормона роста и даже болезнь Пар-

кинсона (Culver, 1994; Lowenstein, 1994). Достаточно удобны-

ми для генетических модификаций оказались и фибробласты ко-

жи, в первую очередь, благодаря легкости генноинженерных ма-

нипуляций ex vivo.