Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,

пульсирующий гель-электрофорез.

Используя столь обширную систему молекулярных маркеров

и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур

или на материале информативных родословных можно довольно

быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не

только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-

ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не-

посредственно к позиционному клонированию с целью выделения

и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в

картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим

подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-

ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро-

мосом и их фрагментов.

Точность цитогенетического картирования определяется

степенью спирализации хромосом, характером использованной

метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо-

вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах

и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти-

рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен-

том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При

использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах

точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1

миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и

растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50

тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,

даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар-

тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-

чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.

Значительно более точные результаты достигаются на 2-м

этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.

Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на

рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.

Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенети-

ческого и молекулярного картирования прямое сопоставление

этих типов физических карт практически невозможно.

Одним из способов преодоления этих трудностей является

конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как

уже упоминалось (см.Глава I,1.5) для приготовления таких

библиотек используют наборы клеточных линий соматических ги-

бридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, ме-

ханически отобранные путем проточной цитометрии. Для некото-

рых видов молекулярного клонирования удобнее оказались биб-

лиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.

Получение таких фрагментов достигается путем целенаправлен-

ного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь

часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны

могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при кото-

рых механически, под контролем микроманипулятора может быть

вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.

Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и

идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по раз-

мерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным

после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК

на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеоти-

дов (Estivill, Williamson, 1987).

Другим важным шагом на пути клонирования и анализа

больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка

методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирую-

щем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith

et al., 1987). В соответствии со стандартными методами

электрофореза под действием однонаправленного постоянного

поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разде-

лять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.

Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем

изменении направления электрического поля происходит, по

-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных

скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переклю-

чения направления поля. При этом более короткие молекулы

легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в

геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего

гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометри-

ческим расположением направлений полей - ортогональный,

гексогональный, инверсионный. При использовании любого из

этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от

50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе-

ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от

условий проведения электрофореза (напряжение, температура

буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка-

честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК

используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной

массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих

специфические последовательности, также может быть осущест-

влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и

идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из

геля и использованы для рестрикционного картирования, пост-

роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с

целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В

последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сег-

ментов ДНК широко используется метод клонирования в

искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения

библиотек генов на основе YAC-векторов.